Príprava a popis mikropreparátov. Domáca mikroskopia
Cieľ: overiť existenciu fenoménu plazmolýzy a deplazmolýzy v živých rastlinných bunkách a rýchlosť fyziologických procesov.
Vybavenie: usmernenia na laboratórne práce, mikroskopy, cibuľová cibuľka, koncentrovaný roztok NaCl, filtračný papier, pipety.
Teoretické informácie:
Všetky živé organizmy sa skladajú z buniek. Všetky bunky, okrem bakteriálnych, sú postavené podľa jedného plánu. Bunkové membrány prvýkrát videl v 16. storočí R. Hooke, skúmajúc rezy rastlinných a živočíšnych tkanív pod mikroskopom. Pojem „bunka“ bol v biológii zavedený v roku 1665.
Existujú rôzne metódy na štúdium buniek, napríklad optická a elektrónová mikroskopia.
Prvý mikroskop navrhol R. Hooke pred 3 storočiami, pričom dával až 200-násobné zväčšenie. Svetelný mikroskop našej doby zväčšuje až 300-krát a viac. Toto zväčšenie však nestačí na to, aby ste videli bunkové štruktúry. V súčasnosti sa používa elektrónový mikroskop, ktorý zväčšuje predmety desať a stotisíckrát (až 10 000 000).
Základné ustanovenia modernej bunkovej teórie:
1.Štruktúra. Bunka je živý mikroskopický systém pozostávajúci z jadra, cytoplazmy a organel.
2.Vznik bunky. Nové bunky vznikajú delením už existujúcich buniek.
3. Bunkové funkcie. V bunke sa vykonávajú tieto činnosti:
Metabolizmus (súbor opakujúcich sa, reverzibilných, cyklických procesov – chemických reakcií);
Reverzibilné fyziologické procesy (príjem a uvoľňovanie látok, podráždenosť, pohyb);
Nevratné chemické procesy (vývoj).
4. Bunka a organizmus. Bunka môže byť nezávislý organizmus, ktorý vykonáva všetky životné procesy. Všetky mnohobunkové organizmy sa skladajú z buniek. Rast a vývoj mnohobunkového organizmu je dôsledkom rastu a rozmnožovania jednej alebo viacerých pôvodných buniek.
5. Bunková evolúcia. Bunková organizácia vznikla na úsvite života a prešla dlhou vývojovou cestou od bezjadrových foriem k jadrovým jednobunkovým a mnohobunkovým organizmom.
Pokrok:
Odstráňte spodnú šupku cibuľových šupín (4 mm2);
Pripravte si mikrosklíčko, preskúmajte a načrtnite 4-5 buniek toho, čo vidíte;
Na jednu stranu krycieho skla naneste niekoľko kvapiek roztoku kuchynskej soli a na druhú stranu odstráňte vodu pásikom filtračného papiera;
Mikrosklíčko skúmajte niekoľko sekúnd. Venujte pozornosť zmenám, ktoré sa vyskytli na bunkových membránach, a času, počas ktorého k týmto zmenám došlo. Načrtnite zmenený objekt;
Naneste niekoľko kvapiek destilovanej vody na okraj krycieho sklíčka a stiahnite ho z druhej strany filtračným papierom, pričom sa zmyje plazmalyzačný roztok;
Sklíčko skúmajte niekoľko minút pod mikroskopom. Všimnite si zmeny polohy bunkových membrán a čas, počas ktorého k týmto zmenám došlo. Načrtnite objekt, ktorý študujete,
Urobte záver v súlade s účelom práce, pričom si všimnite rýchlosť plazmolýzy a deplazmolýzy. Vysvetlite rozdiel v rýchlosti týchto dvoch procesov.
Definujte pojmy - plazmolýza, deplazmolýza, osmóza, turgor.
Vysvetlite, prečo sú jablká v džeme menej šťavnaté?
Predmet:„Porovnanie štruktúry rastlinných a živočíšnych buniek pomocou hotových mikroprípravkov“
(pracovný čas 45 minút)
Cieľ: upevniť schopnosť pracovať s mikroskopom a nájsť funkcie. štruktúru rastlinných a živočíšnych buniek, porovnať ich navzájom.
Vybavenie: pokyny na vykonávanie laboratórnych testov, mikroskopy, hotové mikrosklíčka.
Pokrok
Cvičenie 1. Preskúmajte mikroskopické vzorky rastlinných a živočíšnych buniek pod mikroskopom.
Úloha č.2. Porovnajte štruktúru rastlinných a živočíšnych buniek. Vyplňte tabuľku 1.
Tabuľka 1 „Štruktúra rastlinných a živočíšnych buniek“
Obr. 1 Štruktúra rastlinných a živočíšnych buniek.
Úloha 3. Odpovedz na otázku:
Aké sú podobnosti a rozdiely medzi bunkami?
Aké sú dôvody podobností a rozdielov medzi bunkami rôznych organizmov?
Skúste vysvetliť, ako prebiehal vývoj baktérií, húb, rastlín a živočíchov?
Úloha 4. Urobte záver o práci.
Laboratórna práca č.4
Predmet:„Identifikácia a opis znakov podobnosti medzi ľudskými embryami a inými stavovcami ako dôkaz ich evolučného vzťahu“
(pracovný čas 45 minút)
Cieľ:identifikovať znaky podobnosti medzi ľudskými embryami a inými cicavcami ako dôkaz ich evolučného vzťahu.
Vybavenie: pokyny na vykonávanie laboratórnych testov, tabuľka „Dôkaz o vzťahu medzi ľudskými embryami a inými cicavcami“
Teoretické informácie:
Tvorba zárodočných buniek, gametogenéza je podobná u všetkých mnohobunkových organizmov a všetky organizmy sa vyvinuli z jednej diploidnej bunky (zygoty), čo naznačuje jednotu sveta živých organizmov.
V 20. rokoch minulého storočia si embryológ vedec Karl Baer zapísal do svojho denníka. “Mám 2 malé embryá v alkohole, pre ktoré som zabudol napísať meno a teraz už neviem určiť triedu, do ktorej patria. Môžu to byť jašterice, malé vtáky alebo veľmi mladé cicavce.“
| |
V roku 1928 Karl Baer jasne formuloval túto vlastnosť ako „zákon zárodočnej podobnosti“: čím sa skúmajú skoršie štádiá individuálneho vývoja, tým viac podobností sa nájde medzi rôznymi organizmami. Neskôr Charles Darwin použil túto pozíciu na ospravedlnenie jednoty pôvodu stavovcov.
Súvislosť medzi individuálnym a historickým vývojom organizmu vyjadrili nemeckí vedci Haeckel a Müller. V 2. polovici 19. storočia Haeckel a Müller ustanovili zákon ontogenézy a fylogenézy, ktorý sa nazýval biogenetický zákon. Individuálny vývoj jedinca (ontogenéza) stručne opakuje historický vývoj druhu.
| |
Larvy sú počiatočné štádiá vývoja niektorých zvierat. A niekedy, iba ak sa zaujímate o štruktúru lariev, je možné správne nadviazať rodinné vzťahy medzi organizmami. Ascidiánov, morské živočíchy s mäkkým telom, ktoré sa živia pripútaným životným štýlom, teda nemožno na prvý pohľad nazvať strunatcami. Dlho boli považované za bezstavovce. Počítali, kým nezistili vývoj zvieraťa od voľne plávajúcej larvy až po dospelý organizmus. Vtedy sa ukázalo, že larva má jasne definovaný notochord, dutú nervovú trubicu na dorzálnej strane tela a obojstrannú symetriu. A preto toto zviera patrí do kmeňa strunatcov a pravdepodobnejšie súvisí s kopijou, uznávaným primitívnym strunatcom. 
Obr. 3Ascidián
Homologické sú orgány, ktoré sú si podobné vo všeobecnom štruktúrnom pláne, vo vzťahoch s okolitými orgánmi a tkanivami, v embryonálnom vývoji a napokon v inervácii a zásobovaní krvou (môžu vykonávať rôzne funkcie). Predná plutva tuleňa, krídlo netopiera, predná labka mačky, predná noha koňa a ľudská ruka sú navzájom homológne, hoci na prvý pohľad sú odlišné a prispôsobené na vykonávanie úplne odlišných funkcií. . Všetky tieto orgány majú takmer rovnaký počet kostí, svalov, nervov a krvných ciev umiestnených na rovnakom pláne a cesty ich vývoja sú veľmi podobné. Prítomnosť homologických orgánov, aj keď sú prispôsobené na vykonávanie úplne odlišných funkcií, slúži ako silný argument v prospech spoločného pôvodu organizmov, ktoré ich vlastnia.
Analogické orgány sú orgány, ktoré vykonávajú rovnakú funkciu, ale niekedy majú rôzne štruktúry.
Napríklad krídlo motýľa a vtáka.
Pokrok.
Cvičenie 1. Porovnajte fázy vývoja embrya. Existujú nejaké podobnosti? Ako sa prejavujú? Popíšte ich.
Obr.4 Charakteristiky vývoja embrya v rôznych štádiách.
Úloha 3. Urobte si kvíz na danú tému.
1. Človek v systéme organického sveta:
a) predstavuje špeciálny rad triedy Cicavce;
b) vyniká v osobitnom kráľovstve vrátane najorganizovanejších živých bytostí;
c) predstavuje špeciálny druh, ktorý je zaradený do radu primáty, trieda Cicavce, ríša živočíchov
d) je neoddeliteľnou súčasťouľudskej spoločnosti a nemá žiadny vzťah k systému organického sveta
2. Ľudia sú klasifikovaní ako cicavce, pretože majú:
a) vnútorné oplodnenie;
b) pľúcne dýchanie;
c) štvorkomorové srdce
d) nachádza sa tu bránica, potné a mliečne žľazy
3. V súvislosti so vzpriamenou chôdzou došlo u ľudí k zmenám v stavbe chodidla:
a) vytvorila sa klenba;
b) pazúry sa takmer zmenili na klince;
c) falangy prstov sú zrastené;
G) palec na rozdiel od všetkých ostatných
4. O pôvode človeka z cicavcov svedčí:
a) vyvinuté myslenie u cicavcov;
b) podobná stavba všetkých orgánových sústav, vývoj embryí;
c) jedenie rastlinných a živočíšnych potravín;
d) spoločenský spôsob života cicavcov
5. Na rozdiel od opíc, ľudia:
a) existuje Rh faktor;
b) objavila sa racionálna činnosť;
c) má štvorkomorové srdce;
d) rozvíja sa abstraktné myslenie.
Zapíšte si čísla v poradí narastajúceho hierarchického postavenia človeka v živočíšnej ríši:
1 Zvieratá
3 Cicavce
4 Úzky nos
5 ľudí (Hominida)
6Placentárna
7 Rozumné (sapiens)
8 stavovcov (lebečné)
9Muž (homo)
10Mnohobunkové
11 Akordy
12 Ľudoopov
(Odpoveď 7,9, 5, 12, 4, 2, 6, 3, 8, 11, 1, 10)
Úloha 4. Vyvodiť závery o podobnosti medzi ľudskými embryami a inými cicavcami ako dôkaz ich príbuznosti.
Laboratórna práca č.5
Predmet:„Vypracovanie najjednoduchších schém pre monohybridné a dihybridné kríženie“
(pracovný čas 45 minút)
možnosť 1
Cieľ:
Teoretické informácie:
Pokrok:
Cvičenie 1. Zapamätajte si a zapíšte si do zošita, čo sa nazýva monohybridné a dihybridné kríženie.
Úloha 2. Napíšte prvý Mendelov zákon
Úloha 3. Vyriešte navrhované problémy.
Úloha č.1
Jednotná farba vodných melónov sa dedí ako recesívna vlastnosť. Aké potomstvo vznikne krížením dvoch heterozygotných rastlín s pruhovanými plodmi?
Úloha č.2
U ľudí je gén pre dlhé mihalnice dominantný nad génom pre krátke mihalnice. Žena s dlhými mihalnicami, ktorej otec mal krátke mihalnice, sa vydala za muža s krátkymi mihalnicami.
Zistiť:
1) Koľko druhov gamét produkuje žena?
2) Koľko druhov gamét sa produkuje u človeka?
3) Aká je pravdepodobnosť, že sa v tejto rodine narodí dieťa s dlhými mihalnicami?
5) Koľko rôznych fenotypov môžu mať deti v tejto rodine?
Úloha č.3
Pri krížení dvoch odrôd rajčiaka s červenými guľovitými a žltými hruškovitými plodmi v prvej generácii sú všetky plody guľovité a červené. Určte genotypy rodičov, hybridov prvej generácie, pomer fenotypov druhej generácie (dominantným znakom je červená farba a guľovitý tvar).
Laboratórna práca č.5
Téma: „Vypracovanie najjednoduchších schém pre monohybridné a dihybridné kríženie“
(pracovný čas 45 minút)
Možnosť 2
Cieľ: Naučte sa zostavovať najjednoduchšie mono- a dihybridné schémy kríženia na základe navrhnutých údajov.
Teoretické informácie:
Genotyp je súbor dedičných informácií zakódovaných v génoch.
Fenotyp je konečným výsledkom prejavu genotypu, t.j. súhrn všetkých vlastností organizmu vytvorených v procese individuálneho vývoja v daných podmienkach prostredia.
Variabilita je schopnosť organizmu meniť svoje vlastnosti a vlastnosti. Rozlišuje sa fenotypová (modifikácia) a genotypová variabilita, ktorá zahŕňa mutačnú a kombinačnú (ako výsledok hybridizácie).
Reakčná norma sú limity modifikačnej variability daného znaku.
Mutácie sú zmeny v genotype spôsobené štrukturálnymi zmenami v génoch alebo chromozómoch.
Pokrok:
Cvičenie 1.Zapamätajte si a zapíšte si do zošita, čo sa nazýva dominantná vlastnosť a gén.
Úloha 2. Napíšte druhý Mendelov zákon.
Úloha 3. Vyriešte navrhované problémy.
Úloha č.1
U ľudí dominuje gén pre polydaktýliu (viacprstý) v normálnej štruktúre ruky. Manželka má normálnu ruku, manžel je heterozygot pre gén polydaktýlie. Určte pravdepodobnosť, že sa v tejto rodine narodí viacprsté dieťa.
Úloha č.2
Gén diabetu je recesívny voči normálnemu génu. Zdravému páru sa narodilo dieťa s cukrovkou.
Definuj:
1) Koľko druhov gamét môže produkovať otec?
2) Koľko druhov gamét môže produkovať matka?
3) Aká je pravdepodobnosť narodenia zdravé dieťa v tejto rodine?
4) Koľko rôznych genotypov môžu mať deti v tejto rodine?
5) Aká je pravdepodobnosť, že sa druhé dieťa narodí choré?
Úloha č.3
U ľudí dominujú hnedé oči nad modrými a pravá ruka dominuje ľavej ruke. Aké potomstvo možno očakávať od hnedookého ľaváka a modrookého praváka, ak sú obaja rodičia heterozygotní pre dominantnú vlastnosť?
Laboratórna práca č.6
Ministerstvo školstva a vedy Ruskej federácie
Štátna vzdelávacia inštitúcia vyššieho odborného vzdelávania
"Šadrinský štátny pedagogický inštitút"
Katedra prírodných vied s vyučovacími metódami
Metódy prípravy mikrovzoriek v biológii
Práca na kurze
špecializácia 050102 „Biológia“
vykonávateľ:
Gorshkova Jekaterina Andreevna
Študent 3. ročníka denného štúdia
Vedecký poradca:
Kandidát biologických vied, docent
Sharypova Nadezhda Vladimirovna
_________________________________
Stupeň ____________________________
Šadrinsk
2014
Úvod ………………………………………………………………………………………………. 3
§ 1. Charakteristika mikroprípravkov a ich použitie……………………….4
§ 2. Zariadenie potrebné na prípravu mikrosklíčok…….7
§ 3. Príprava materiálu na prípravu mikrosklíčok………………...12
§ 4. Metódy prípravy mikrosklíčok……………………………………….17
Záver……………………………………………………………………………………………… 31
Bibliografia………………………………………………………….32
Dodatok ………………………………………………………………………………………...34
Úvod
Relevantnosť výskumnej témy. Mikroprípravky sú názorným vyučovacím prostriedkom, a preto sa hojne využívajú na hodinách biológie pri laboratórnych cvičeniach, pri štúdiu nového učiva, zovšeobecňovaní, porovnávaní a kladení otázok.
Vzhľadom na nedostatočné zásobovanie učební biológie už hotovými mikrodiapozitívmi, ktoré sú potrebné pre kvalitnejšie štúdium predmetu, je možné ich zhotoviť samostatne.
Na základe jej relevantnosti sme zvolili nasledujúcu výskumnú tému: „Metódy prípravy mikropreparátov v biológii“.
Predmet štúdiasú mikroprípravky.
Položka metódy prípravy mikrosklíčok.
Účel štúdie: štúdium typov mikropreparátov v biológii a spôsobov ich prípravy.
Ciele výskumu:
- Preštudujte si a analyzujte literatúru na túto tému.
- Uveďte charakteristiku mikropreparátov a rady o ich použití na hodinách biológie.
- Popíšte vybavenie potrebné na prípravu mikrosklíčok.
- Naučte sa pripraviť materiál na prípravu mikrosklíčok.
- Študijné metódy prípravy mikrosklíčok.
Na dosiahnutie cieľov a zámerov sa použili nasledujúcevýskumné metódy:analýza vedeckej a metodologickej literatúry k výskumnej téme, experimentálna výskumná práca a zovšeobecnenie jej výsledkov.
Štruktúra kurzu. Práca v kurze pozostáva z úvodu, 4 odsekov a záveru, uvádza sa bibliografia vrátane 16 zdrojov, 1 príloha.
§ 1. Charakteristika mikropreparátov a ich použitie
Prírodne pripravené materiály zahŕňajú herbáre, vlhké prípravky a mikroprípravky.
Mikropreparát je tenký rez orgánu živého organizmu alebo mikročastice, uzavretý v priehľadnom balzame (imerzný olej) alebo vysušený, umiestnený medzi dvoma pohármi (sklíčko a kryt).
Pôvod mikrosklíčok začína použitím slonoviny alebo obyčajnej kosti ako podpery pre vzorky, ktoré boli umiestnené medzi disky z priehľadnej sľudy. Podobný dizajn bol populárny vo viktoriánskom Anglicku, kým Royal Microscopic Society nepredstavila štandardizované mikroskopické sklíčko.
Mikrovzorky umožňujú demonštrovať vnútornú bunkovú stavbu organizmov, čo pomáha žiakom rozvíjať poznatky o jednotnej bunkovej stavbe organizmov. Mikropreparáty možno rozdeliť do dvoch skupín:
- trvalé, továrenské vyrobené špeciálne na školenie;
- dočasné, pripravené učiteľom na vyučovaciu hodinu alebo počas vyučovacej hodiny samotnými žiakmi na jednorazové použitie.
Permanentné mikropreparáty sú najtenšie úseky tkanív organizmov a ich orgánov. Väčšina buniek je nezafarbená, a preto aj pri veľkom zväčšení mikroskopu môže byť ťažké vidieť vnútrobunkové štruktúry vrátane jadra. V tomto ohľade sú bunkové mikropreparáty zafarbené špeciálnymi farbivami, aby boli viditeľnejšie. Učitelia by určite mali deti upozorniť, že farba nie je pre mikroštruktúry prirodzená. Používajú sa pri štúdiu nového materiálu, zovšeobecňovaní, porovnávaní a spochybňovaní.
Dočasné drogy sa tak nazývajú, pretože netrvajú dlho. Po oboznámení sa s mikroobjektom sa dočasný prípravok z podložného sklíčka zmyje. Príprava mikrosklíčka je jednou z povinných zručností rozvíjaných v kurze biológie od 6. ročníka.
Na štúdium živých buniek mikroorganizmov sa používajú prípravky „drvená kvapka“, „visiaca kvapka“, „odtlačok“, „agarový film“ („mikrokultúra“). Preparáty živých buniek sa skúmajú „suchými systémami“ mikroskopu. Prípravky, s ktorými už bola práca dokončená, sa pred umytím uchovávajú v dezinfekčnom roztoku.
Mikroprípravky umožňujú vykonávať širokú škálu experimentov uvedených v osnovách školského kurzu biológie. Sú určené na podrobné štúdium mikroskopických štruktúr pod mikroskopom.
Pred prácou s mikrosklíčkom musí učiteľ žiakom jasne vysvetliť, čo majú vidieť, pomocou tabuliek, nákresov, schém atď.
Počas prieskumu učitelia často používajú „tiché“ (bez štítkov) mikrosklíčka. Študenti dostanú za úlohu identifikovať mikroskopické preparáty a porozprávať sa o štruktúre konkrétneho tkaniva. Identické mikrosklíčka je vhodné skladovať v jednom balení, aby ich bolo možné rýchlo distribuovať študentom.
Mikrosklíčka sa skladujú mimo vykurovacích zariadení a tak, aby podložné sklíčko bolo vo vodorovnej polohe, aby sa zabránilo „skĺznutiu“.
Požiadavky na mikropreparáty:
- Sklo musí byť bezfarebné a priehľadné. Krycie sklo musí byť tenšie ako podložné sklo, ktoré slúži ako základ produktu.
- Mikroprípravok musí byť vycentrovaný, t.j. umiestnený v strede krycieho skla. Umiestnenie veľmi malého objektu by malo byť označené rámom.
- Mikroskopické rezy musia byť veľmi tenké a musia mať všetky prvky potrebné na štúdium.
- Jednotlivé tkanivá mikrosklíčka musia byť zafarbené jasným, permanentným farbivom.
- Mikrovzorky musia byť vydané vo forme súpravy pre každú sekciu kurzu biológie. Počet liekov s rovnakým názvom v sade by mal postačovať na laboratórnu prácu všetkým žiakom v triede (15-20 ks).
- K súboru mikropríprav by mali byť priložené metodické odporúčania, ktoré by mali obsahovať nákresy študovaných mikroobjektov a úlohy na samostatnú prácu študentov.
Štúdium mikropreparátov počas procesu učenia zoznamuje študentov s metódami vedy a umožňuje priamym pozorovaním vidieť stavbu organizmov a ich častí.
Mikropreparáty sú mikroskopicky malé živé predmety, najtenšie časti ich orgánov a častí. Tieto predmety sú uzavreté medzi krycím sklom a podložným sklom v špeciálnom riešení. Pre lepšiu viditeľnosť sú prípravky zafarbené, takže zafarbenie predmetov je umelé.
1. Skôr ako začnete pracovať s mikrosklíčkom, musíte si zapísať jeho názov a tému laboratórnej hodiny.
2. Štúdium akéhokoľvek mikropreparátu začína skúmaním pod mikroskopom pri malom zväčšení (56x). Potom si vyberú miesto, kde sú detaily lepšie viditeľné, nastavia veľké zväčšenie (120-300x) a začnú skicovať. Pri skicovaní mikrosklíčka je potrebné dodržať pomer veľkostí jednotlivých častí predlohy. Skicovanie pomáha lepšie si zapamätať a vytvoriť vizuálnu reprezentáciu objektu.
3. Najprv sú na obrázku uvedené hlavné prvky, potom sú doplnené o detaily. Pod nákresom je napísaný názov mikrosklíčka a zväčšenie, pri ktorom bola kresba vytvorená. Urobte 2-3 kresby na jednu stranu žiackeho zošita. Hlavné štruktúry mikrovzorky sú označené ukazovateľmi a oproti každému je napísané číslo, po ktorom nasleduje ich dekódovanie. Obrys zorného poľa mikroskopu nie je vyznačený.
Existujú teda 2 typy mikrosklíčok: dočasné a trvalé. Ich rozdiel spočíva v čase skladovania a spôsoboch varenia. Mikrovzorky musia spĺňať určité požiadavky, ktoré je potrebné starostlivo dodržiavať. Na prípravu mikrosklíčok potrebujete špeciálne vybavenie, ktoré je popísané v nasledujúcom odseku.
§ 2. Zariadenia potrebné na prípravu mikrosklíčok
Desktop.
Pri absencii špeciálneho stola je možné úspešne prispôsobiť akýkoľvek stôl (najlepšie so zásuvkami) s pracovnou plochou najmenej 60 x 120 cm.
Ak kryt stola nemá špeciálny povlak, mal by byť vyrobený z nejakého materiálu odolného voči vlhkosti. V každom prípade však musí byť plocha stola určená na priamu prácu na príprave prípravkov pokrytá sklom a pod ňou umiestnené malé (9 x 12 cm) listy bieleho alebo čierneho papiera. Tým sa vytvorí vhodné pozadie, ktoré uľahčuje prácu s maľovanými (biely list) a nenatretými (čierny list) predmetmi. Odporúča sa tiež naniesť obrys podložného skla na obe dosky s uvedením umiestnenia a veľkosti krycieho skla.
Pre pohodlnejšie usporiadanie potrebného vybavenia by ste mali mať dvojposchodovú policu na reagencie, roztoky a náčinie, ktorá je inštalovaná buď pred pracujúcou osobou (pozdĺž zadného okraja stola) alebo na boku, v závislosti od na umiestnenie stola vzhľadom na svetelný zdroj.
Sklo.
Poháre so širokým hrdlom so zabrúsenými zátkamirôznych objemov od 50 do 200 ml sa používajú na zostavenie histologických batérií určených na prípravu kúskov tkaniva na plnenie rôznymi médiami. Väčšie dózy sa používajú na fixáciu a skladovanie kúskov tkaniva pri fixácii tekutín, pri spracovaní podložných sklíčok, príprave neutrálneho formaldehydu atď.
Namiesto dóz so zabrúsenými zátkami môžete použiť malé domáce dózy s plechovým šróbovacím uzáverom rôznych veľkostí.
Vedrá malé okrúhle sklenené poháre rôznych priemerov a výšok s lešteným vrchnákom.
Biologické poháreokrúhle, oválne alebo štvoruholníkové (rovnako ako vysoké fľaše) sa používajú na vedenie histologických rezov pripevnených na podložné sklíčka. Aby bola zaistená stabilita a poriadok v usporiadaní, sú umiestnené v špeciálnych stojanoch vyrobených z dreva alebo plastu, niekoľko kusov v rade, v závislosti od spôsobu spracovania.
Petriho misky široké, ploché sklenené misky s vrchnákom sú vhodné na rôzne manipulácie (farbenie voľne plávajúcich dielov a dielov nalepených na podložných sklíčkach, použitie ako stojany na navažovačky a pod.).
Meracie náčinie valce a kadičky rôznych objemov (od 10 do 250-500 ml) lieviky rôznych veľkostí.
Chemické kadičkyokrúhle sklenené poháre bez viečok s objemom 50-100 ml sa široko používajú pri vykonávaní histochemických reakcií, farbiacich rezov nalepených na sklo atď.
Banky (s plochým dnom) s objemom od 50 ml do 2 litrov. Malé banky sa používajú na prípravu a skladovanie roztokov rôznych farbív, veľké banky sa používajú na destilovanú vodu a iné kvapaliny spotrebované vo veľkých množstvách.
Pipety konvenčné (určené na vkvapkávanie liekov) sa používajú na nakvapkávanie farbív a rôznych tekutín na rezy, odstupňované (s objemom 0,1-100 ml) sa používajú na meranie malých množstiev rôznych tekutín. Možno použiť v súčasnosti široko používané automatické pipety rôznych kapacít.
Snímkyobdĺžnikové platne s rozmermi 76*25 mm, hrúbka 1,2-1,4 mm, určené na ukladanie rezov pri príprave mikrosklíčok. Hrubšie sklá neumožňujú získanie ostrého obrazu okrajov clony iluminátora v rovine preparátu, pretože tá končí v hrúbke skla, čo narúša zaostrenie kondenzora a výrazne znižuje jasnosť obrazu.
Krycie páskysú tenké (hrubé 0,15-0,17 mm, hrubšie sklá zhoršujú kvalitu obrazu) platne rôznych veľkostí. Podávajte na zakrytie spracovaných častí umiestnených na podložných sklíčkach. Veľkosti krycích skiel sa vyberajú v závislosti od plochy objektu.
Nástroje.
Medzi nástroje používané v histologickom laboratóriu patria pinzety, skalpely, hemostatické kliešte, kliešte, bakteriologické slučky, špachtle, pitevné ihly – rovné aj zakrivené, kovové a sklenené. Sklenené ihly sú potrebné na impregnáciu striebra, keď nie je možné použiť kovové ihly.
Ďalej je potrebné mať liehovú lampu, kefu na vlasy na vyberanie rezov z noža mikrotómu, filtračný papier, ihly, nite, hrubý papier na označenie materiálu, náplasť a sklenenú ceruzku.
Príprava diapozitívov.
Sklíčka použité na získanie histologických preparátov sa musia pripraviť vopred. Výnimkou sú hotové a špeciálne balené dovážané diapozitívy.
Sklíčka sa umyjú v teplej mydlovej vode alebo sa 15 minút povaria v 2 – 3 % roztoku hydrogénuhličitanu sodného, potom sa opláchnu horúcou vodou a niekoľko hodín sa perú v tečúca voda. Umyté poháre sa poutierajú čistou bavlnenou handričkou a vložia sa na niekoľko dní do 96% alkoholu. Odtučnené poháre sa z tejto zmesi vyberú pinzetou, utrú sa čistou handričkou a vložia sa do škatule.
Sklíčka sa dajú dobre odmastiť aj v silnom roztoku kyseliny chlorovodíkovej. Po niekoľkých dňoch sa umyjú tečúca voda a sušené.
Kvalitu odmastenia je možné skontrolovať nakvapkaním vody z pipety na podložné sklíčko: voda sa rozprestrie v tenkej vrstve na odmastenom skle a nezhromažďuje sa v kvapke.
Pre lepšiu fixáciu sekcií na skle je vopred namazaná zmesou proteínu a glycerínu. Čerstvý vaječný bielok sa vyšľaha a prefiltruje cez filter s hrubými pórmi navlhčený destilovanou vodou, potom sa zmieša s rovnakým objemom glycerínu a pridá sa niekoľko kryštálov tymolu. Zmes sa môže skladovať niekoľko mesiacov. Používa sa aj zmes, ktorá obsahuje 15 ml krvného séra, 5 ml destilovanej vody a 6 ml 5 % formaldehydu. Po filtrácii je zmes pripravená na nanesenie na podložné sklíčka. Jeho použitie poskytuje lepšie výsledky ako použitie vaječného bielka, pretože pri farbení nevzniká žiadne pozadie.
Na nanesenie proteínu na odmastené podložné sklíčka vezmite do jednej ruky 5-6 pohárov vo forme vejára a do druhej čistú sklenenú tyčinku, ktorou sa proteín nanáša, dotýkajúc sa každého pohára. Potom sa bielkovina rozotrie s nízkotučným alkoholom prstom po povrchu pohára do jeho stredu, pričom sa použije malá sila. Niektorí autori odporúčajú nahrievať poháre potreté bielkovinou v termostate, ale skúsenosti ukazujú, že je to zbytočné, pretože po preložení na poháre sa tieto ukladajú do termostatu alebo na špeciálny stôl na sušenie, kde súčasne dochádza ku koagulácii bielkoviny. .
Bola vyvinutá metóda na pripevnenie rezu na podložné sklíčko bez toho, aby sa podložné sklíčko najskôr potieralo proteínom a glycerolom.
Nakvapkajte niekoľko kvapiek tekutého kazeínového lepidla do kúpeľa s teplou destilovanou vodou a premiešajte. Rezy sa ponoria do vzniknutej zakalenej tekutiny, narovnajú sa pitevnou ihlou a zachytia sa na čisté sklo zbavené mastnoty.
Táto metóda dáva vždy dobrý efekt a okolo rezu nie je žiadne farebné pozadie, ako to často býva pri použití proteínu.
Na prípravu mikrosklíčok je teda potrebné špeciálne vybavenie a nástroje. Hlavné sú posuvné a krycie sklo. Pred začatím prípravy mikrosklíčka je potrebné sklíčka správne pripraviť. Špeciálne požiadavky sú aj na ich skladovanie. Samotná príprava zariadenia však na prípravu mikrosklíčok nestačí, je potrebné pripraviť aj materiály na výskum. Toto je podrobne popísané v nasledujúcom odseku.
§ 3. Príprava materiálu na prípravu mikrosklíčok
Mikropreparáty sa delia na dočasné a trvalé. Príprava materiálu na dočasné prípravky zahŕňa fixáciu a farbenie.
Fixácia je proces rýchleho uchovania bunkových štruktúr, pri ktorom sa zastavia všetky fyziologické a biochemické procesy a vo vode rozpustné látky prechádzajú do nerozpustného stavu. V dôsledku toho fixácia umožňuje zachovať vnútrobunkové štruktúry nezmenené po dlhú dobu. Počas fixácie sa však v bunkách môžu objaviť artefakty – nové štruktúry, ktoré v živej bunke chýbajú, napríklad rôzne vakuoly. Aby sa zabránilo vzniku artefaktov, je potrebné použiť špeciálne vybrané chemické roztoky a fixačné prostriedky a samotná fixácia sa musí vykonať za určitých podmienok. Najmä je vhodné použiť chladené fixačné prostriedky (do 2-3 stupňov); na fixáciu musíte odobrať jednotlivé bunky alebo kúsky tkaniva nie hrubšie ako 5 mm; objem fixačného prostriedku by mal presiahnuť objem fixovaného materiálu 50-100 krát; držiak by sa nemal používať na dlhodobé skladovanie materiálu; držiak sa nesmie znovu použiť.
Uvažujme o zložení a aplikácii najpoužívanejších fixačných prostriedkov.
Formalín (formaldehyd alebo formaldehyd). Najjednoduchší a najpoužívanejší držiak. Používa sa vo forme vodných roztokov s koncentráciou 4-10%, pričom koncentrácia komerčného formalínu sa berie ako 100%. Komerčný formalín obsahuje prímes kyseliny mravčej, ktorá sa do 24 hodín neutralizuje uhličitanom vápenatým. Doba fixácie od 1 hodiny do 24 hodín. Pre dlhodobé skladovanie sa materiál prenesie do čerstvého 10% formaldehydu. Čistý formalín sa používa, ak sa plánuje ďalšie štúdium lokalizácie a aktivity enzýmov. Častejšie je formalín zahrnutý do formulácie zložitejších fixačných prostriedkov.
Alkoholové fixátory. Obsahuje etyl alebo metylalkohol. Vodné roztoky alkoholov v čistej forme (70 %, 96 % alebo 100 %) sa používajú pomerne zriedkavo. Častejšie sa používajú 100% alkoholy, ktoré sa miešajú s inými látkami. Treba mať na pamäti, že metylalkohol (metanol) a jeho výpary sú jedovaté.
Ako univerzálne fixačné prostriedky sa používajú rôzne kompozície na báze formaldehydu, alkoholov, organických kyselín a anorganických látok.
Ocotový alkohol (acetálový alkohol). Toto je jedna z najjednoduchších svoriek. Skladá sa z 3 dielov absolútneho alkoholu (etyl, alebo ešte lepšie metylalkoholu) a 1 dielu ľadovej kyseliny octovej. Na prípravu 100% (absolútneho) alkoholu sa východiskové alkoholy dehydrujú. Bezvodý síran meďnatý sa používa na dehydratáciu etylalkoholu (etanol) a oxid vápenatý sa používa na dehydratáciu metylalkoholu (metanol). Skladujte ich vo vzduchotesnej nádobe. Treba mať na pamäti, že všetky absolútne alkoholy sú obzvlášť jedovaté. Na prípravu ľadovej kyseliny octovej sa pôvodná koncentrovaná kyselina ochladí v chladničke; v tomto prípade kyselina zamrzne skôr ako voda. Kvapalina sa vypustí a zmrazená kyselina sa rozmrazí a použije sa na prípravu fixačného prostriedku. Fixátor je pripravený na použitie po 24 hodinách. Fixačný prostriedok skladujte na tmavom a chladnom mieste. Doba fixácie 2...24 hodín. Potom sa materiál prenesie do čerstvého fixátora, v ktorom sa môže skladovať až 1 mesiac v chladničke. Pre dlhšie skladovanie sa materiál preloží do 70% alkoholu.
Carnoyov fixátor. Zloženie absolútny alkohol 10 cm 3 ; chloroform 3 cm 3 ; kyselina octová 1 cm 3 . Doba fixácie je 1-3 hodiny.
Fixatíva s obsahom kyseliny pikrovej, napríklad Bouinova zmes 15 ml nasýteného vodného roztoku kyseliny pikrovej: 5 dielov formaldehydu: 1 diel ľadovej kyseliny octovej. Tento fixátor sa pripravuje bezprostredne pred použitím. Doba fixácie je od 1 do 24 hodín (niekedy aj niekoľko dní). Fixovaný materiál je uložený v 70% liehu.
Fixatíva s obsahom chloridu ortutnatého (II) HgCl 2 ). Sublimát sa používa vo forme nasýteného vodného roztoku v zmesi s ľadovou kyselinou octovou (25:1), formaldehydom (8,5:1) a zložitejšími kompozíciami (fixátor Suza, fixátor Zenker atď.). Doba fixácie od 1 do 24 hodín. Potom sa chlorid ortutnatý odstráni alkoholovým roztokom jódu (6 dielov 70% alkoholu: 1 diel jódovej tinktúry) a jód sa odstráni 70% alkoholom. Fixovaný materiál je uložený v 70% liehu.
Fixatíva obsahujúce osmium (oxid osmium alebo kyselina osminová). Poskytujú najlepšie výsledky a používajú sa pri príprave prípravkov pre svetelnú aj elektrónovú mikroskopiu. Môžete použiť 1-2% roztok kyseliny osmiovej, ale častejšie sa používajú kompozície, napríklad Flemingov fixátor 15 dielov 2% kyseliny osmiovej: 1 diel ľadovej kyseliny octovej. Fixácia prebieha pomaly (od 24 hodín do niekoľkých dní).
Okrem uvedených univerzálnych západiek existujú aj špeciálne západky. Napríklad mitochondriálny fixátor obsahuje 4 diely 3% roztoku dvojchrómanu draselného a 1 diel 40% formaldehydu. Fixátor na chloroplasty obsahuje 15 dielov nasýteného roztoku síranu meďnatého, 1 diel 40% formalínu a 5 dielov vody.
V niektorých prípadoch sa namiesto chemickej fixácie používa rýchle zmrazenie vzoriek, napríklad pri teplote tekutého dusíka (196 0 ) alebo pri teplote suchého ľadu (78 0 ). Zmrazené predmety možno dehydrovať sublimáciou vody vo vákuu pri teplotách pod 40 °C 0 (tento proces sa nazýva lyofilizácia).
Farbenie umožňuje identifikovať vnútrobunkové štruktúry, ktoré majú zvýšenú afinitu k určitým farbivám. Farbivá sú organické látky s relatívne nízkou molekulovou hmotnosťou, ktoré majú zvýšenú afinitu k určitým chemickým zložkám bunky.
Existuje veľa farbív, ktoré sa používajú na rôzne účely. Treba mať na pamäti, že výber farbiva súvisí s povahou fixácie a rôznymi spôsobmi predúpravy buniek.
Názvy farbív môžu zodpovedať výslednej farbe (rubínová, karmínová, metylová modrá, metylénová modrá, genciánová violeť, metylová zelená, oranžovo zlatá). Niekedy sa ruské názvy kvetov nahrádzajú nemeckými, napríklad: metylblau, genciánová fialová. V ostatných prípadoch sú názvy abstraktné, historické, napr.: pyronín, fuchsín, safranín, floroglucinol, sudan III. Niekedy názov farbiva nezodpovedá výslednej farbe, napríklad modrý tionín dáva fialovo-červenú farbu. Chemické názvoslovie farbív sa používa pomerne zriedkavo, napr.: dimetylaminobenzaldehyd, kyselina 8-amino-1-naftol-5-sulfónová.
Existujú zásadité (alkalické), kyslé a neutrálne farbivá. Bázické farbivá selektívne farbia bazofilné bunkové štruktúry (to znamená štruktúry s kyslými vlastnosťami). Kyslé farbivá selektívne farbia acidofilné alebo oxyfilné bunkové štruktúry (to znamená štruktúry s alkalickými vlastnosťami). Neutrálne farbivá farbia bazofilné aj acidofilné štruktúry.
Na intravitálne farbenie buniek sa používajú najmenej toxické farbivá. Tieto farbivá sa zvyčajne používajú vo forme vodných roztokov, napríklad: metylénová modrá (koncentrácia od 1:1000 do 1:10000), trypánová modrá (0,5% roztok), neutrálna červená (od 1:50000 do 1:200000).
Farbivá pre fixované bunky sa môžu použiť v čistej forme (vodné alebo alkoholové roztoky, koncentrácia od 0,1% do 1%), napríklad: eozín, fuchsín. Často sa používajú zmesi farbív, napríklad zmes Romanovsky-Giemsa (obsahuje metylénovú modrú, metylénovú fialovú, metylénovú modrú a eozín), farbivo Mallory (sekvenčné použitie kyslého fuchsínu S a potom zmes anilínovej modrej a oranžového zlata G) , azúrový eozín, metylblueozín.
Častejšie však farbivo vzniká pri jeho príprave. Napríklad známa látka rastlinného pôvodu Hematoxylín sa stáva farbivom až po jeho oxidácii na hemateín. Farbivá v kombinácii s organickými kyselinami sa široko používajú na farbenie jadier a chromozómov. Pozrime sa na spôsoby prípravy niektorých najjednoduchších farbív.
Príprava 2% acetofuchzínu. 1 gram zásaditého fuchsínu sa pri zahrievaní vo vodnom kúpeli rozpustí v 50 ml 40 % kyseliny octovej.
Príprava 1% acetorceínu. Pridajte 50 ml ľadovej kyseliny octovej k 1 gramu orceínu a nechajte pôsobiť asi 12 hodín. Potom sa zmes zahreje do varu a pridá sa 50 ml destilovanej vody. Potom zahrejte do varu a ochlaďte, pričom tento postup zopakujte 10-krát. Po 24 hodinách sa farbivo prefiltruje. Pred farbením pridajte 1 diel 1 N na 9 dielov farbiva. HCl.
Príprava 4% acetokarmínu. Roztok sa pripraví v žiaruvzdornej banke s vodným chladičom. 4 gramy acetokarmínu sa zmiešajú so 100 ml 50% kyseliny octovej a varia sa 1 hodinu. Po 24 hodinách sa farbivo prefiltruje. Acetolakmoid sa pripravuje podobným spôsobom.
Namiesto kyseliny octovej sa často používajú iné organické kyseliny, napríklad 40% kyselina mliečna.
Po príprave sa všetky farbivá filtrujú a uchovávajú na chladnom a tmavom mieste. Doba farbenia prípravkov závisí od teploty (zvyčajne od 20 minút do 1 dňa). Pri zahrievaní alebo varení sa skracuje čas farbenia.
Okrem farbenia organickými farbivami možno jednotlivé štruktúry rozlíšiť pomocou ich impregnácie striebrom a inými kovmi.
Pri príprave niektorých dočasných mikrosklíčok je teda potrebná fixácia a farbenie študovaného materiálu. Vďaka tomu lepšie uvidíte predmet pod mikroskopom. Konkrétne o metódach prípravy mikrosklíčok si povieme v štvrtom odseku.
§ 4. Metódy prípravy mikrosklíčok
Pri výrobe dočasných mikrosklíčok je potrebné dodržať nasledujúcu postupnosť operácií:
1. Podložné a krycie sklíčko umyte a dôkladne osušte. Aby ste neporušili veľmi krehké krycie sklíčko, vložte ho do záhybu obrúska medzi palec a ukazovák pravej ruky a krúživými pohybmi prstov ho jemne utrite.
2. Naneste kvapku tekutiny (voda, glycerín, roztok, činidlo alebo farbivo) na sklíčko pomocou pipety.
3. Pomocou čepele urobte rez skúmaným orgánom. Čepeľ musí byť veľmi ostrá.
4. Vyberte najtenšiu časť a preneste ju pomocou pitevnej ihly alebo tenkej kefy do stredu podložného sklíčka do kvapky tekutiny.
5. Sekciu prikryte krycím sklom, aby sa pod ňu nedostal vzduch. Za týmto účelom uchopte krycie sklo za okraje dvoma prstami a spodný okraj prisuňte šikmo k okraju kvapky kvapaliny a hladko ho spustite.
6. Ak je tekutiny veľa a vyteká spod krycieho skla, odstráňte ju pomocou filtračného papiera. Ak sú pod krycím sklom priestory naplnené vzduchom, pridajte tekutinu tak, že jej kvapku dáte blízko okraja krycieho skla a na opačnú stranu filtračný papier.
Učitelia biológie a vedúci krúžkov skôr či neskôr stoja pred úlohou zhotoviť výučbovú mikrosklíčko. Aký druh látky je schopný fixovať biologický objekt na dlhú dobu a ako urobiť tento postup jednoduchým a dostupným. Známe balzamy (fixačné živice) neboli nikdy považované za ľahko dostupné látky, najmä ďaleko od veľkých miest. Okrem toho hovoria, že tieto látky nie sú neškodné. A nakoniec, proces ich používania je dosť ťažký.
Na výrobu lieku môžete použiť lepidlo PVA. Dôležité je, aby bol prípravok vlhký, dobre navlhčený a lepidlo čerstvé a mierne zriedené čistou studenou prevarenou vodou na požadovanú koncentráciu (lepidlo je emulzia a ľahko sa riedi). Po niekoľkých pokusoch a omyloch je možné bez problémov zostaviť a určiť požadovanú koncentráciu.
Potom sa na čisté sklíčko nanesie kvapka prevarenej alebo destilovanej vody. Vodu treba opatrne odstrániť čistou handričkou bez chĺpkov alebo filtračným papierom, aby bolo sklo mierne vlhké. To, ako aj vlhkosť vzorky, podporuje rovnomerné (bezbublinové) zmáčanie. Naneste malú kvapku vopred pripraveného PVA lepidla na pripravený povrch tak, aby nevznikli vzduchové bubliny. Niekedy neprekážajú, ale vzhľad droga je pokazená. Do tejto kvapky sa opatrne prenesie vopred pripravený rez alebo vzorka, napríklad dafnia predtým usmrtená horúcou vodou. Potom plynulým nakloneným pohybom položte na vrch krycie sklo, tiež čisté a mierne vlhké. Vrstva lepidla medzi sklami by mala byť čo najtenšia.
Ak sa niečo nepodarí a vzorka je hodnotná a dostatočne veľká, takmer vždy, na rozdiel od živíc, je možné ju umyť obyčajnou vodou a postup zopakovať. Prebytočné lepidlo sa opatrne umyje tenkým prúdom vody; treba dbať na to, aby netečie medzi poháre. Krycie sklo treba držať. Mierne zakalené zvyšky vody je možné opatrne odstrániť filtračným papierom alebo prúžkom tenkej látky, ktorá nepúšťa vlákna.
Pripravené prípravky by mali byť položené na teplom a suchom mieste. Ukazovateľom pripravenosti lieku je jeho transparentnosť. V závislosti od mnohých faktorov trvá sušenie do priehľadného stavu jeden až štyri týždne. Stáva sa, že príliš hrubá vrstva lepidla alebo lepidlo znečistené nečistotami úplne nespriehľadní, čo trochu znehodnocuje obraz, ale vďaka malej hĺbke ostrosti mikroskopu sú aj takéto prípravky dostupné na štúdium.
Nie je zaručené, že tento spôsob je možné použiť na výrobu akýchkoľvek prípravkov, pretože niektoré vyžadujú farbenie a farbivá môžu reagovať s lepidlom.
T.N. Lashkina, učiteľka biológie a ekológie na strednej škole č. 23, z mesta Syzran, ponúka nasledujúcu metódu prípravy mikrosklíčok. Môžete si vziať obyčajnú želatínu a naplniť ju vodou, aby napučala. Potom naberte do polievkovej lyžice trochu napučanej želatíny (bez vody) a zohrejte na ohni. Keď sa želatína rozpustí (nechcete, aby sa uvarila), dajte ju na podložné sklíčko. Vložte vzorku do tejto kvapky a prikryte ju krycím sklíčkom; prstom ju dobre zatlačte, aby sa želatína rovnomerne rozdelila. Mikroprípravok je pripravený.
Ak nie sú k dispozícii krycie sklíčka, namiesto krycieho sklíčka je možné použiť celofán. Celofán má navyše jednu výhodu: mikroprípravok sa nedá rozdrviť, pretože Celofán je elastický a nepraská ako krycie sklo.
So želatínou treba pracovať rýchlo, inak stuhne. Ale ak sa to stane, stačí držať pohár nad ohňom a želatína sa znova stane tekutou. Želatína je neškodná, dostupná a veľmi ekonomická.
Príprava rezov rastlín
Na výrobu rezov sa predmet odoberie palcom a ukazovákom ľavej ruky a jeho povrch sa vyhladí skalpelom alebo nožom. Vezmite čepeľ alebo žiletku do pravej ruky a plynulým a rýchlym pohybom po predmete smerom k vám a doprava (pozri prílohu obr. 1, A). Rezy by mali byť malé a tenké. Z čepele sa odstránia mäkkou kefkou a prenesú sa na podložné sklíčko v kvapke média (pozri prílohu obr. 1, B).
Na výrobu rezov malých predmetov sa tieto vložia do jadra bazy čiernej (pozri prílohu obr. 2), pričom sa v ňom predtým urobí rez alebo priehlbina, a vykoná sa vyššie opísaná operácia. Čepeľ používaná na rezanie musí byť ostrá (mala by ľahko strihať vlasy).
Mikropreparáty v botanike
Príprava rezu epidermis zo spodnej strany listu Tradescantia virginiana v kvapke vody.
Na prípravu prípravku omotajte list Tradescantia okolo ukazováka ľavej ruky tak, aby fialová spodná strana smerovala von. Pravou rukou pomocou pitevnej ihly roztrhnite epidermis nad stredným rebrom v strednej časti listu a kúsok z nej odstráňte pinzetou. V tomto prípade je nedobrovoľne zachytená aj časť dužiny listov (mezofyl), ale zvyčajne na periférii nájdete tenkú oblasť pozostávajúcu z jedného radu epidermálnych buniek. Odtrhnutý kus položte na podložné sklo do kvapky vody vonkajšou stranou nahor a prikryte krycím sklíčkom.
Príprava kanadských listových buniek Elodea.
V hornej časti výhonku elodea odtrhnite pomocou pinzety list a preneste ho do kvapky vody na podložnom sklíčku. List by mal byť umiestnený spodnou stranou smerom k podložnému sklíčku.
Príprava chromoplastov v bunkách zrelého ovocia.
Pitecou ihlou odoberte malé kúsky dužiny zrelých plodov konvalinky, jarabiny a šípky. Položte každý kúsok do kvapky vody na podložnom skle a opatrne oddeľte bunky. Prikryte krycím sklíčkom.
Príprava zŕn zemiakového škrobu.
Zemiakovú hľuzu nakrájajte. Z čerstvo narezanej plochy odoberte skalpelom malé množstvo vznikajúcej tekutiny a preneste ju do kvapky vody na podložnom sklíčku, prikryte krycím sklíčkom.
Príprava kamenných buniek oplodia hrušky.
Na časti čerstvého alebo alkoholom fixovaného oplodia hrušky nájdite skupinu kamenných buniek a odstráňte ich. Položte na sklíčko a rozdrvte špičkou skalpela.
Na kamenné bunky naneste kvapku 1% roztoku floroglucinolu v 50% etanole, potom pridajte niekoľko kvapiek koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej (pri práci s koncentrovanou kyselinou je potrebné dodržiavať bezpečnostné opatrenia).
Lignifikované škrupiny získajú čerešňovo-červenú alebo karmínovú farbu.
Po zafarbení odstráňte činidlo filtračným papierom, pridajte kvapku glycerolu a prikryte prípravok krycím sklíčkom.
Príprava prieduchov rastlinných buniek.
Pripravte niekoľko častí spodnej epidermy listu a vložte ich do 5% roztoku glycerínu na 2 hodiny. Rezy sa umiestnia na podložné sklo v rovnakom roztoku. Zvažujú drogu.
Potom nahraďte glycerín vodou a vytiahnite ho spod pohára filtračným papierom. Pozerajú sa na to, čo sa zmenilo.
Potom sa voda nahradí 20% roztokom glycerolu alebo 1M roztokom sacharózy. Pozorujú sa zmeny (pozri prílohu obr. 3).
Príprava mikropreparátov v zoológii
Príprava prípravku z najjednoduchších organizmov senného nálevu.
Pomocou sklenenej tyčinky naneste na sklíčko kvapku roztoku metylcelulózy.
Pomocou pipety nakvapkajte senný nálev do tohto roztoku. Kvapku prikryte krycím sklíčkom. Preskúmajte pod mikroskopom[ 6 ] .
Príprava mikrosklíčok o fyziológii človeka
Príprava náteru krv na štúdium leukocytového vzorca.Na suché sklíčko sa nanesie kvapka krvi (pozri prílohu obr. 4, a). Brúsne sklo je nastavené pod uhlom 45° k predmetu. Keď sa krv dostane do kontaktu s brúsnym sklom, šíri sa po jeho okraji (pozri prílohu obr. 4, b). Potom sa brúsne sklo rýchlym pohybom posunie dopredu a posúva sa po povrchu sklíčka. V tomto prípade sa krv natrie na podložné sklíčko v tenkej rovnomernej vrstve (pozri prílohu Obr. 4, c).
Dobre pripravený krvný náter vyzerá pri vyšetrení žltkastý, jednotný a priehľadný. V tomto prípade sú vytvorené prvky krvi umiestnené v jednej vrstve.
Príprava mikrosklíčok podľa mikrobiológie
Príprava prípravkov z mŕtvych mikrobiálnych buniek.
Na podrobné štúdium mikroorganizmov sa používajú fixné mikropreparáty. Po fixácii sú mikróby usmrtené a potom zafarbené.
Príprava fixovaných prípravkov pozostáva z nasledujúcich operácií: príprava náteru, sušenie prípravku, jeho fixácia, farbenie a sušenie.
Fáza 1: Technika prípravy náterov (pozri prílohu obr. 5).
- Príprava náteru z hustého živného média
- malá kvapka fyziologického roztoku sa nanesie v slučke na odmastené podložné sklíčko;
- vezmite bakteriologickú slučku do pravej ruky a skúmavku s kultúrou do ľavej ruky;
- slučka sa sterilizuje umiestnením do plameňa horáka vo zvislej polohe (do červena) (pozri prílohu Obr. 5-1);
- odstráňte zátku zo skúmavky, uchopte ju malíčkom pravej ruky a okraj skúmavky spálite na alkoholovej lampe (pozri prílohu Obr. 5-2,3);
- slučka sa zavedie do skúmavky, ochladená dotykom stien, potom sa z povrchu média odstráni malé množstvo kultúry (pozri prílohu obr. 5-4);
- slučka sa vyberie bez toho, aby sa dotkla stien skúmavky, okraje skúmavky sa spália nad alkoholovou lampou a uzatvoria sa zátkou (pozri prílohu obr. 5-5,6);
- zachytená mikrobiálna kultúra sa pridá do kvapky fyziologického roztoku, dôkladne sa premieša a rovnomerne rozloží po pohári vo forme oválu, kruhu alebo štvorca s plochou 1-1,5 cm 2 (pozri prílohu Obr. 5-7);
- po dokončení prípravy náteru sa slučka opäť sterilizuje (pozri prílohu obr. 5-8).
- Pri vytváraní náteru z kultúr z tekutých živných médií sa 1-3 slučky testovaného materiálu nanesú na podložné sklíčko a rovnomerne sa naň rozložia; v tomto prípade sa nevyžaduje použitie fyziologického roztoku. Potom postupujte podľa popisu vyššie.
Fáza 2: Sušenie náterov.
Pripravený náter sa suší na vzduchu, nad plameňom horáka (nie však v plameni), v prúde teplého vzduchu alebo v termostate.
Musíte vedieť, že zahrievanie môže narušiť štruktúru mikróbov a tiež, že neúplne vysušený prípravok sa pri fixácii pokazí.
3. fáza: Fixácia ťahov.
Existujú fyzikálne a chemické metódy. Pri fixácii fyzikálnou metódou sklo 3-4 krát pomaly prechádza plameňom s náterom nahor. V tomto prípade mikroorganizmy zomrú, náter je pripevnený k sklu a nie je zmytý. Z nedostatočne fixovaného náteru sa zmyjú mikróby, v príliš fixovanom nátere sa pozoruje deštrukcia mikroorganizmov, to znamená rozpad na samostatné fragmenty.
Fixácia chemickou metódou sa dosiahne ponorením náterov do fixačnej kvapaliny, ktorá môže slúžiť ako:
Alkohol (15-20 minút)
Éter alkoholu (10-15 minút)
metylalkohol (5 minút)
Chloroform (niekoľko sekúnd)
Vychladený acetón (5 minút)
Fáza 4: Farbenie škvŕn.
Farbenie mikroorganizmov má veľkú diagnostickú hodnotu. Ide o zložitý fyzikálno-chemický proces, v mechanizme ktorého významnú úlohu zohrávajú javy adsorpcie, vzlínavosti, chemická afinita medzi farbivami a natieraným predmetom a pH prostredia, v ktorom sa nachádzajú.
Na farbenie mikroorganizmov existujú jednoduché (indikatívne) a zložité (diferenciálne) metódy.
Jednoduché sfarbenie.
Jednoduché farbenie baktérií odhalí len ich morfológiu (tvar, veľkosť a vzájomnú polohu mikróbov). Zvyčajne sa používa iba jedno farbivo (metylénová modrá alebo genciánová violeť). Existujú pozitívne a negatívne metódy farbenia.
Pozitívne:
- Pripravený a fixovaný náter sa umiestni do špeciálneho mostíka nad vaňou.
- Na určitý čas naneste akékoľvek farbivo (množstvo farby by malo byť také, aby pokrylo celý povrch rozmazania, stačí niekoľko kvapiek). V tomto prípade je potrebné zabezpečiť, aby farbivo na nátere nezaschlo, v prípade potreby sa na náter nalejú nové dávky farbiva.
- Potom dôkladne a rýchlo opláchnite vodou.
- Vysušte filtračným papierom.
- Aplikuje sa kvapka imerzného oleja a skúma sa pod mikroskopom.
Náter sa považuje za vysoko kvalitný, ak sa baktérie nachádzajú izolovane od seba a sú rovnomerne sfarbené.
Negatívne:
Pri tejto metóde je pozadie náteru zafarbené, ale mikroorganizmy zostávajú nezafarbené. Používa sa na štúdium mikroorganizmov, ktorých schránky neprijímajú ľahko anilínové farbivá (leptospiry, spirochéty).
- Kvapka atramentu sa nanesie na okraj podložného sklíčka a pomocou slučky sa zmieša s kvapkou kultúry.
- Náter sa urobí pomocou okraja lešteného podložného sklíčka rovnakým spôsobom ako pri príprave krvného náteru (pozri prílohu Obr. 6). Sklíčko je umiestnené na vodorovnom povrchu a držané ľavou rukou; pravou rukou ju posuňte smerom k poklesu pod uhlom 45 0 brúsne sklo, pozdĺž ktorého okraja sa kvapka rovnomerne rozprestiera; Okamžite pevne pritlačte brúsne sklo v rovnakej polohe pod uhlom a posuňte ho doľava pozdĺž sklíčka, čím získate rovnomerný rozmazaný náter.
- Nechajte zaschnúť a mikroskopujte.
Diferenciálne (komplexné) sfarbenie.
Komplexné alebo diferenciálne metódy farbenia baktérií sú založené na charakteristikách fyzikálno-chemickej štruktúry mikrobiálnej bunky. Umožňujú pomocou niekoľkých roztokov farbív a činidiel určiť morfologické vlastnosti a štruktúrne zložky bunky (spóry, tobolky, bičíky atď.).
Jednou z najdôležitejších metód je Gramovo farbenie mikróbov. Ide o univerzálnu diferenciálnu diagnostickú metódu farbenia, ktorú navrhol dánsky vedec Gram v roku 1884. Používa sa ako jeden z kľúčov v mikrobiálnych identifikátoroch.
Gramové farbenie mikróbov.
Gramová identita mikróbov závisí od chemického zloženia bakteriálnej bunky a štruktúry bunkovej steny.
- Na fixovaný náter položte malý kúsok filtračného papiera a na 1-2 minúty zalejte roztokom genciánovej violeti.
- Odstráňte papier, vypustite farbu a bez oplachovania vodou nalejte Lugolov roztok na prípravok na 1 minútu (rozmazanie sčernie).
- Ošetrite náter alkoholom na 30 sekúnd (2-3 krát ponorte do pohára).
- Umyte vodou.
- Okrem toho farbiť zriedeným fuchsínom po dobu 1-2 minút.
- Farba sa scedí, premyje vodou, vysuší filtračným papierom a skúma ponorným systémom.
Gram-pozitívne mikroorganizmy sa farbia na fialovo, nie sú bielené alkoholom a nevnímajú zásaditý fuchsín. Gramnegatívne mikroorganizmy sa alkoholom odfarbia a získajú ružovo-červenú farbu z farbenia fuchsínom.
Detekcia kapsúl pomocou negatívneho kontrastu.
Malý počet buniek z pevného živného média sa umiestni do slučky na podložnom sklíčku v kvapke zriedeného fuchsínu, zmieša sa s kvapkou atramentu, prikryje sa krycím sklíčkom a skúma sa pod mikroskopom. Na sivom pozadí prípravku sú jasne viditeľné bezfarebné kapsuly, okolité bunky mikroorganizmov sú sfarbené do ružova.
Farbenie endospór.
- Metylénová modrá (podľa Lefflera) sa naleje na fixovaný náter.
- Farbivo sa privedie do varu pridržaním sklíčka pinzetou nad plameňom horáka. Keď sa farbivo vyparí, pridá sa. Trvanie maľovania je trikrát, každý 10-15 sekúnd.
- Sklíčko sa ochladí a dôkladne sa umyje vodou.
- Dodatočne do 30 sekúnd dokončite náter 0,5% vodným roztokom safranínu (alebo Ziehl fuchsínu).
- Farbivo sa scedí, prípravok sa premyje vodou, suší a skúma pod mikroskopom.
Pri správnom zafarbení sú vegetatívne bunky červené a spóry modré (svetlo ružové).
Fáza 5: Sušenie.
Vodu, ktorá zostala na pohári po umytí, opatrne odstránime filtračným papierom, prípadne odsatím okrajom papiera, prípadne jemným pritlačením kúska papiera na maz. Natretý náter musí byť úplne suchý, pretože zvyšná voda tvorí s cédrovým olejom naneseným na náter zakalenú emulziu, ktorá narúša mikroskopiu.
Príprava preparátov živých buniek mikroorganizmov.
Metóda štúdia mikróbov v živom, nepoškvrnenom stave má tieto výhody:
- Mikróby sa skúmajú v ich neporušenej forme.
- Pozorovanie mikróbov v živej forme nám umožňuje identifikovať množstvo vlastností, ktoré sa u usmrtených mikróbov nenachádzajú (aktívna motilita).
Metóda má však aj niekoľko nevýhod:
- Je ťažké študovať nezafarbené mikróby kvôli ich malej veľkosti.
- Neschopnosť sústrediť sa na mikrób na dlhú dobu, pretože sa rýchlo pohybuje mimo dohľadu.
V živom stave sa mikróby skúmajú v „rozdrvenej kvapke“, „visiacej kvapke“ a „odtlačku“ a do úvahy sa berie aj „agarový film“; v niektorých prípadoch sa používa intravitálne (vitálne) farbenie mikróbov.
Droga „rozdrvená kvapka“.
Na podložné sklíčko sa umiestni kvapka vody, do nej sa vloží malý počet buniek skúmaných mikroorganizmov, premieša sa a prikryje sa krycím sklíčkom. Mikroorganizmy pestované na plochom aj v tekutom živnom médiu sa prenesú do kvapky vody s bakteriologickou slučkou; pestované v tekutom médiu možno preniesť aj sterilnou pipetou. Pri dlhodobom štúdiu mikroskopického predmetu sa odporúča vyplniť okraje krycieho skla lakom na nechty, ktorý zabráni rýchlemu vysychaniu preparátu (viď. príloha obr. 7).
Príprava závesnej kvapky.
Kvapka suspenzie mikroorganizmov sa nanesie slučkou alebo bežným perom na krycie sklíčko, ktoré sa otočí kvapkou nadol a umiestni sa na špeciálne sklíčko s priehlbinou (jamkou) v strede. Kvapka by mala voľne visieť bez toho, aby sa dotýkala okrajov a dna otvoru. Okraje otvoru sú vopred namazané vazelínou. Kvapka je utesnená vo vlhkej komore, čo umožňuje pozorovanie objektu po mnoho dní. Na dlhodobé pozorovania sa používajú sterilné sklá a pripravuje sa suspenzia mikroorganizmov v tekutom živnom médiu. Pri práci s baktériami sa používa zriedka (pozri prílohu obr. 8).
Príprava „odtlačkov prstov“.
Z agarového média, na ktorom rastú mikroorganizmy v súvislom trávniku alebo vo forme jednotlivých kolónií, vyrežte skalpelom malú kocku a preneste ju na podložné sklíčko tak, aby povrch s mikroorganizmami smeroval nahor. Potom sa na trávnik alebo kolóniu priloží čisté krycie sklo, zľahka sa naň pritlačí slučkou alebo pinzetou a ihneď sa odstráni, pričom treba dávať pozor, aby sa nepohlo do strany. Výsledný prípravok sa umiestni potlačou nadol do kvapky vody alebo metylénovej modrej (1:40) na podložné sklíčko. Odtlačok možno získať aj na podložnom sklíčku dotykom povrchu kolónie alebo trávnika podložným sklíčkom. Používajú sa najmä pri štúdiu sporulácie streptomycét.
Príprava „agarového filmu“ (alebo „mikrokultúry“).
0,2-0,3 ml horúceho agarového živného média sa nanesie na tenké sterilizované a nahriate sklenené podložné sklíčko sterilnou nahrievanou pipetou a rozdelí sa po celom povrchu skla. Po stuhnutí média odstráňte prebytočný agar pomocou slučky, pričom ponechajte dva tenké časti filmu, každý vo veľkosti krycieho skla. Do stredu štvorcov sa pomocou bakteriálnej slučky alebo pipety nanesie kvapka tekutej kultúry alebo suspenzie buniek mikroorganizmov. Pohár sa vloží do vlhkej komory (Petriho miska s vrstvou vlhkého filtračného papiera), ktorá je umiestnená v termostate. Pred mikrokopírovaním sa na film s vyrastenou mikrokultúrou nanesie kvapka farbiva alebo kvapka vody, ak film vyschne a potom sa opatrne prikryje krycím sklíčkom.
Intravitálne sfarbenie mikróbov.
Pri práci s rozdrvenou kvapkou, pre lepšiu viditeľnosť mikróbov, môže byť kvapalina mierne zafarbená zavedením malej kvapky farbiva pod krycie sklíčko. V tomto prípade sa baktérie zafarbia a budú jasnejšie viditeľné v zornom poli mikroskopu.
1 spôsob farbenia:
- Nasýtený vodný roztok metylénovej modrej sa nanesie na čisté sklíčko.
- Nechajte zaschnúť.
- Sklo utierajte filtračným papierom, kým povlak nezíska svetlomodrý odtieň.
- Kvapka testovaného materiálu sa umiestni na sklíčko a prikryje sa krycím sklíčkom.
- Mikróby postupne modrú a zostávajú nažive.
Druhý spôsob farbenia:
Kvapka testovaného materiálu sa zmieša na podložnom sklíčku s farbou (0,1-0,01 %), prikryje sa krycím sklíčkom a skúma sa pod mikroskopom.
Skúmali sme teda, aké metódy existujú na prípravu dočasných aj trvalých mikropreparátov a z akých organizmov sa dajú pripraviť. Zistili sme, že mikropreparáty sú široko používané vo všetkých biologických vedách.
ZÁVER
Štúdium vedeckej a metodologickej literatúry nám umožnilo dospieť k záveru, že mikropreparáty sú široko používané na hodinách biológie, a preto je potrebné ich vyrobiť.
Mikropreparáty sa delia na dočasné a trvalé. Dočasné prípravky sa neskladujú, pripravujú sa počas laboratórnych prác, bezprostredne pred štúdiom objektu. Trvalé prípravky je možné skladovať mnoho rokov. Vyrábajú sa prevažne priemyselne, no pripraviť si ich môžete aj sami.
Mikroprípravky podliehajú určitým požiadavkám na výrobu, skladovanie a použitie, ktoré je potrebné dodržiavať.
Pred vyučovaním musí učiteľ žiakov poučiť, ako správne zaobchádzať s mikrosklíčkami.
Na prípravu mikropreparátov pre biológiu je potrebné špeciálne vybavenie a nástroje: podložné sklíčka, krycie sklá, pipety, Petriho misky, rôzne banky, pitevné ihly, pinzety, skalpely, alkoholové lampy atď. Zariadenie používané pri príprave mikrovzoriek, ako aj napr. mikrosklíčka majú požiadavky na skladovanie a prípravu, ktoré sa musia tiež dodržiavať.
Niekedy je potrebné materiál na mikrosklíčka fixovať a farbiť, na čo sa používajú špeciálne farbivá a fixačné prostriedky.
Mikrosklíčka sa dajú pripraviť rôznymi spôsobmi. Patrí sem príprava rezov, náterov, odtlačkov, príprava mikrosklíčok živých buniek organizmov (visiaca kvapka, rozdrvená kvapka, potlač, agarový film) - to všetko sú dočasné mikrosklíčka. Materiálom pre nich môžu byť rôzne časti rastlín, tkanivá, mikroorganizmy.
BIBLIOGRAFICKÝ ZOZNAM
- Bavtuto G.A. Workshop o anatómii a morfológii rastlín [Text] / G.A. Bavtuto, L.M. Yerey. M.: Nové vydanie, 2002. 464 s. : chorý.
- Mikrobiológia [Text]: metodické odporúčania pre vedenie laboratórnych hodín pre študentov biológie / komp. N.V. Sharypova - opravené, doplnené - Shadrinsk, 2009. - 47 s., chor.
- Workshop z anatómie a morfológie rastlín [Text]: učebnica. pomoc pre študentov vyššie učebnica prevádzkarne / V.P. Viktorov, M.A. Gulenková, L.N. Dorokhin a ďalší; Ed. L.N. Dorokhina. - M.: Akadémia, 2001. 176 s.
- Workshop z mikrobiológie [Text]: učebnica. pomoc pre študentov vyššie učebnica inštitúcie / A.I. Netrusov, M.A. Egorová, L.M. Zakharchuk a kol.; Ed. A.I. Netrusová. M.: Akadémia, 2005. 608 s.
- Workshop z fyziológie rastlín [Text]: učebnica. pomoc pre študentov vyššie ped. učebnica inštitúcie / I.V. Plotniková, E.A. Zhivukhina, O.B. Mikhalevskaja a ďalší; Ed. V.B. Ivanova. M.: Akadémia, 2001. 144 s.
- Suchanova L.V. Zošit pre laboratórne práce (7.-8. ročník) [Text] / L.V. Suchanova // 1. septembra: vyd. dom 1. septembra. 2004. Číslo 25-26. S. 36-46.
- Barinov O.G. [Elektronický zdroj]. Režim prístupu:http://bio.1september.ru/articlef.php?ID=200104304. - Názov z obrazovky.
- Wikipedia [elektronický zdroj]. - Režim prístupu:http://ru.wikipedia.org/wiki/Micropreparation- titulok z obrazovky.
- Smernice[elektronický zdroj]. - Režim prístupu:http://freecode.pspo.perm.ru/080/work/METODICKÉ ODPORÚČANIA. htm- titulok z obrazovky.
- http://labx.narod.ru/documents/micropreparaty.html- titulok z obrazovky.
- Mikroskopická technika v biológii [elektronický zdroj]. - Režim prístupu:http://labx.narod.ru/documents/microscope_slides.html- titulok z obrazovky.
- Mikroskopická technika v biológii [elektronický zdroj]. - Režim prístupu:http://labx.narod.ru/documents/prigotovlenie_micropreparatov.html- titulok z obrazovky.
- Webová stránka učiteľa biológie [elektronický zdroj]. - Režim prístupu:http://tana.ucoz.ru/load/436-1-0-354- titulok z obrazovky.
- Roh Ruska. Povaha Kuzbassu [elektronický zdroj]. - Režim prístupu:http://prirodakem.narod.ru/Biblioteka/My_st/doci/kl_ob.htm- titulok z obrazovky.
- Firma "Nové lýceum" [elektronický zdroj]. - Režim prístupu:http://novylicey.narod.ru/microprep_3_5.htm - názov z obrazovky.
- Elektronická knižnica Štátnej štátnej univerzity (Gorno-Altaisk Štátna univerzita) [elektronický zdroj]. - Režim prístupu:http://elib.gasu.ru/eposobia/papina/malprak1/R_1_2.html- titulok z obrazovky.
Aplikácia
Ryža. 1. Poloha rúk pri rezaní (A) a odstraňovaní rezov žiletkou (B)
Ryža. 2. Predmet vložíme do jadra bazy čiernej.
Ryža. 3. Príprava mikrosklíčka.
Zakrytie predmetu krycím sklom.
Ryža. 4. Schéma prípravy krvného náteru
Ryža. 5. Príprava prípravku náteru
Ryža. 6. Príprava náteru.
Ryža. 7. „Crushed drop“: pohľad zhora a zboku
Ryža. 8. „Hanging drop“: pohľad zhora a zboku
Na štúdium mikroorganizmov sa mikroskopia vykonáva na živých aj mŕtvych mikróboch v nezafarbenej a zafarbenej forme. Na podložnom sklíčku sa pripraví mikroskopický preparát - tenká sklenená platňa (76x26 mm) s dobre vyleštenými okrajmi. Podložné sklíčka používané na mikrobiologický výskum musia byť krištáľovo čisté a úplne bez mastnoty. Na povrchu odmasteného skla sa voda ľahko šíri a netvorí guľovité kvapôčky.
Nové poháre sa pred použitím varia 10 minút v 1% roztoku sódy, umyjú sa vodou, slabou kyselinou chlorovodíkovou a dobre sa opláchnu v destilovanej vode. Použité sklo musí byť ošetrené roztokom kyseliny sírovej počas 2 hodín, dobre opláchnuté vo vode a varené 10 minút v 4% roztoku sódy. Sklo, potom opláchnuté destilovanou vodou, sa utrie čistou ľanovou handričkou.
Laboratórium by malo mať vždy pripravenú zásobu pohárov na použitie. Najlepšie je skladovať sklíčka v pohári so zabrúsenou zátkou, ponorené do zmesi alkoholu a éteru, odobratých v rovnakých objemoch. Sklenené podložné sklíčka sa z nádoby vyberú pomocou pinzety. Krycie sklá sú tenké kusy skla vyrezané do štvorca alebo obdĺžnika (hrúbka 0,15-0,17 mm) s rozmermi 18x18 mm, 20x20 mm, 18x24 mm.
Štúdium živých mikroorganizmov
Mikroorganizmy je možné mikroskopovať v živom aj v mŕtvom (fixovanom) stave na špeciálne pripravených prípravkoch. Plesne a kvasinky sa najlepšie považujú za živé v prípravku „rozdrvených“ kvapiek. Bunky týchto mikroorganizmov sú pomerne veľké a mikroskopia zvyčajne v živom stave jasne odhalí ich tvar, veľkosť, niektoré detaily vnútornej stavby, ako aj charakter rozmnožovania (pučenie, delenie, sporulácia atď.).
Kvôli ich malej veľkosti sa baktérie často vyšetrujú mŕtve na fixovaných, zafarbených prípravkoch. V tomto prípade sa získa jasnejšia predstava o tvare a veľkosti buniek a ich schopnosti tvoriť spóry. Baktérie sa považujú za živé v „rozdrvenej“ kvapke, keď je určená ich schopnosť pohybu.
Droga je „rozdrvená“ kvapka. Na odtučnené podložné sklíčko s kalcinovanou slučkou sa nanesie kvapka sterilnej vody, do ktorej sa tou istou slučkou pridá malé množstvo kultúry mikroorganizmov (kvasinky alebo baktérie) odobraté z pevného živného média. Kultúra sa odoberie z tekutého média spolu s kvapkou tekutiny a ak je to potrebné, pridá sa kvapka sterilnej vody. Suspenzia mikrobiálnej kultúry na skle by mala vytvárať len mierny zákal. Pri mikroskopovaní kvasiniek sa do kvapky tekutiny na skle pridáva malé množstvo metylénovej modrej v slučke (kým nezmodrie) a celá zmes sa dôkladne premieša. Intravitálne farbenie kvasiniek metylénovou modrou sa používa na identifikáciu odumretých buniek, ktoré sa ľahko farbia na modro. Živé bunky zostávajú nezafarbené, pretože neumožňujú farbivu prejsť cez ich membránu.
Kvasinkový prípravok pripravený na podložnom sklíčku sa prekryje krycím sklíčkom a skúma sa objektívom 40X. V takomto prípravku sú zvyčajne dobre viditeľné priehľadné oválne alebo okrúhle kvasinkové bunky s jadrami a membránami, ktoré sú dobre viditeľné v živých kvasinkových bunkách. Mŕtve bunky sú zvyčajne menšie ako živé bunky a sú sfarbené do modra.
Prípravok živých baktérií sa pripravuje podobne ako prípravok z kvasníc, ale baktérie je možné prezerať bez pridania farbiva. Na povrch krycieho sklíčka sa nanesie kvapka imerzného oleja a preparát sa prezerá 90-násobným imerzným objektívom, najlepšie v tmavom poli (t. j. so zatvorenou clonou). Ak je bakteriálna kultúra mobilná, potom sú zreteľne viditeľné rýchle, rôzne pohyby jednotlivých buniek.
Na prípravu prípravku z plesňových húb veľmi opatrne (aby sa nezničili sporulačné orgány) pomocou špeciálnej ihly (môže byť pitva) alebo botanickej pinzety odstráňte kúsok hubového filmu a preneste ho do predtým aplikovanej kvapky vody. na sklíčko. Preparát sa opatrne, ľahko stlačí, prekryje krycím sklíčkom a skúma sa pod mikroskopom s objektívom 8X. Pri tomto zväčšení je jasne rozlíšená štruktúra sporulačných orgánov plesňových húb. Pre detailné preštudovanie jednotlivých štrukturálnych detailov (hýfy, vaky a pod.) sa preparát skúma 40X šošovkou. V tomto prípade je nevyhnutné upraviť osvetlenie pomocou clony, aby ste získali jasnejší obraz príslušných detailov.
Pri príprave prípravkov v drvenej kvapke si musíte pamätať na nasledujúce:
1. Pri spúšťaní krycieho skla na kvapku by ste sa mali okrajom dotknúť okraja kvapky a postupným nakláňaním sklo znižovať.
2. Kvapka by nemala byť veľká, aby tekutina nepretiekla cez okraje a nespadla na hornú stranu krycieho sklíčka. Prebytočná voda sa odstráni kúskom filtračného papiera.
3. Jednotlivé vzduchové bubliny zostávajúce pod krycím sklíčkom zvyčajne neprekážajú pri pozorovaní. Ale ak je veľa bublín, liek by sa mal pripraviť znova.
4. Prípravok by nemal byť príliš hustý, aby sa mikroorganizmy navzájom nezakrývali.
5. Pripravené preparáty sa ihneď skúmajú (najmä živé baktérie), pretože inak voda vysychá a bakteriálne bunky strácajú svoju pohyblivosť.
6. Bakteriologická slučka (alebo ihla) pred a po každej ďalšej pasáži (nakvapkanie kvapky vody do pohára, vybratie kultúry z agaru a premiešanie, nabratie farby atď.) musí byť rozpálená v plameni horáka. .
Po kalcinácii sa slučka rýchlo ochladí na vzduchu (podržte 2-3 sekundy bez toho, aby ste sa ničoho dotkli) a začne sa ďalšia fáza práce.
Štúdium mikroorganizmov v pevnej a farebnej forme
Príprava náteru. Materiál sa nanáša na čisté, odmastené podložné sklíčko pomocou platinovej slučky (obr. 62). Ak je tekutý, potom sa kvapka odobratá v slučke priamo rovnomerne rozloží po povrchu podložného skla v tenkej vrstve na ploche približne 1 cm2. Ak sa študuje agarová kultúra, potom sa na podložné sklíčko najskôr nanesie kvapka sterilnej vody, v ktorej sa skúmaná kultúra rozloží v tenkej vrstve. To má za následok takzvaný maz. Všetky manipulácie na prípravu náteru sa musia vykonávať v súlade s pravidlami asepsie (slučky, konce nádob s testovaným materiálom, vatové zátky atď. sa sterilizujú nad plameňom horáka). Po vytvorení náteru sa vysuší pri izbovej teplote a umiestni sa na špeciálny sušiaci stôl (obr. 63). Dobrý ťah štetcom by mal po zaschnutí zanechať sotva viditeľný povlak. Droga s hustým rozmazaním je na pozorovanie málo užitočná.
Na urýchlenie sušenia môžete náter opatrne vysušiť nad plameňom horáka. V tomto prípade je sklíčko držané nad plameňom horáka tak, aby škvrna smerovala nahor.
Fixácia náteru. Na hranici medzi svetlými a tmavými časťami plameňa sa 3 až 4-krát vykoná sklíčko so zaschnutým náterom smerom nahor od plameňa horáka. Účelom fixácie je zabiť mikrobiálne bunky, prichytiť ich na sklo a uľahčiť farbenie. Mŕtve bunky vnímajú farbu oveľa lepšie ako živé bunky. Liek by nemal byť v plameni celkovo dlhšie ako 2 sekundy. Je potrebné sa vyhnúť nadmernému zahrievaniu náterov, pretože to výrazne mení štruktúru buniek a náter sa nebude dobre farbiť. Ak nie je škvrna dostatočne fixovaná, môže sa pri následnom lakovaní zmyť. V praxi sa dostatočnosť ohrevu zisťuje priložením podložného skla na ruku. Malo by sa cítiť mierne pálenie.
Farebné ťahy. V laboratórnej praxi sa používajú jednoduché a zložité metódy farbenia mikróbov. Komplexné alebo diferenciálne metódy farbenia, ako už bolo uvedené, sa používajú na podrobné štúdium bunkovej štruktúry. Na jednoduché farbenie prípravkov sa na zafixovaný náter naleje niekoľko kvapiek farbiaceho roztoku (metylénová modrá, zriedený fuchsín atď.). Na získanie čistejších prípravkov sa odporúča naliať roztok farbiva na kúsok filtračného papiera, ktorý sa používa na zakrytie rozmazania. V priemere sa roztok farby udržiava na nátere 2-3 minúty (v závislosti od typu farby). Fuchsin sa farbí intenzívne a všetky druhy baktérií sa farbia rovnako dobre. Doba farbenia roztokom fuchsínu je úplne dostatočná na 1-2 minúty. Alkalická metylénová modrá sa nechá škvrnu zafarbiť 2-3 minúty. Farbí menej výrazne, ale prípravok je elegantnejší a okrem toho rôzne baktérie získavajú farbu rôznej intenzity. Pri farbení metylénovou modrou veľké bunky (napríklad kvasinky) diferencujú jadro a cytoplazmu. Roztok genciánovej violete sa uchováva na farbenie 3-5 minút.
Po uplynutí stanovenej doby sa farba zo sklíčka vypustí. Ak bol na náter položený filtračný papier, treba ho opatrne odstrániť pinzetou a potom opláchnuť miernym prúdom destilovanej vody (alebo vody z vodovodu). Prúd vody by mal smerovať na okraj sklíčka, nie na rozter. Premytý prípravok sa suší na vzduchu pri izbovej teplote alebo pomocou prúžkov filtračného papiera.
Naneste kvapku cédrového oleja na suchý náter. Cédrový olej by sa nemal nanášať na vlhký (a najmä vlhký) náter. V tomto prípade vzniká emulzia vody v cédrovom oleji a jasnosť obrazu v mikroskope prudko klesá.
Podstatou zložitých metód farbenia je, že prípravok nie je natretý jedným, ale dvoma alebo veľkým počtom kontrastných farieb. V mikrobiologickej praxi je pri rozlišovaní mikróbov veľmi dôležitá komplexná metóda farbenia mikróbov podľa Grama.
Technika farbenia mikróbov pomocou Gramovej metódy je nasledovná. Na fixovaný náter sa položí prúžok filtračného papiera a na 1-2 minúty sa prileje karbolický roztok genciánovej violeti. Potom sa farba vypustí. Po odstránení papiera a bez opláchnutia prípravku vodou aplikujte Lugolov roztok na náter na 1-2 minúty (náter sčernie). Po určenom čase sa Lugolov roztok z podložného sklíčka vypustí a sklo sa ponorí do pohára s alkoholom, aby sa odfarbilo. Podložné sklíčko sa mierne pretrepáva v alkohole 30-60 sekúnd. Náter sa rýchlo premyje vodou a dodatočne sa farbí zriedeným fuchsínom počas 1-2 minút. Fuchsín sa scedí, prípravok sa premyje vodou, suší a mikroskopicky skúma.
Gramovo farbenie mikróbov sa môže uskutočniť pomocou modifikácie tejto metódy navrhnutej Sinevom. Namiesto roztoku karbolickej genciánovej violete použite filtračný papier namočený v tomto roztoku a vysušený. Prúžok takéhoto papiera sa položí na pevný náter, nanesie sa niekoľko kvapiek sterilnej vody, aby sa papier navlhčil, a prípravok sa 2 minúty farbí. Potom sa papier odstráni, na prípravok sa naleje Lugolov roztok a potom sa postupuje rovnakým spôsobom, ako je uvedené vyššie pri farbení podľa Grama.
Vo vzťahu k farbeniu podľa Grama sú všetky baktérie rozdelené do dvoch skupín: gram-pozitívne (gram-pozitívne) a gram-negatívne (gram-negatívne). Prvé v dôsledku sfarbenia zostávajú fialové; tie sa odfarbia alkoholom a po dodatočnom zafarbení fuchsínom získajú červenú farbu. Vysvetľuje to skutočnosť, že u grampozitívnych baktérií cytoplazma buniek obsahuje špecifické proteíny a horečnatú soľ kyseliny ribonukleovej, ktoré tvoria fialový komplex s genciánovou violeťou a jódom, ktorý nie je ničený alkoholom. V gramnegatívnych baktériách horčíková soľ ribonukleovej kyseliny v bunkách chýba a pri farbení genciánovou violeťou a jódom takýto komplex v cytoplazme nevzniká. Genciánová violeť a jód sa neskôr ľahko odfarbia alkoholom.
Príprava farbiacich roztokov
V bakteriologickom výskume sa na farbenie mikróbov používajú základné anilínové farbivá. Najčastejšie sa používajú: bazická purpurová (červené farbivo), metylénová modrá (modré farbivo), genciánová violeť, kryštálová violeť, metylfialová (fialové farbivá). Tieto farby sa predávajú vo forme amorfných alebo kryštalických práškov, z ktorých sa pripravujú farbiace roztoky.
Východiskovým materiálom na prípravu potrebných pracovných farieb sú nasýtené alkoholové roztoky uvedených farbív. Alkoholové roztoky sa pripravujú na budúce použitie a uchovávajú sa vo fľašiach so zabrúsenými zátkami. Samotné alkoholové roztoky sa nepoužívajú na farbenie mikróbov.
Nasýtený alkoholový roztok farbiva sa pripraví rozpustením jeho 1 g v 10 ml 96 % etylalkoholu (etanolu). Farba sa zvyčajne úplne nerozpustí a na dne fľaše zostane malý sediment. Výsledný alkoholový roztok sa infúzi 3-5 dní, denne sa pretrepáva.
Pracovný vodno-alkoholový náterový roztok sa pripraví zmiešaním 1 ml nasýteného liehového roztoku s 10 ml destilovanej vody. Pre zvýšenie farbiacej schopnosti sa kyselina karbolová pridáva ako moridlo do vodno-alkoholických roztokov farieb.
Recepty na prípravu najbežnejšie používaných farieb.
Carbol fuchsin Tsilya. 10 ml nasýteného alkoholového roztoku zásaditého fuchsínu sa zmieša so 100 ml 5 % kyseliny karbolovej. Roztok farbiva si môžete pripraviť priamo zo suchého farbiva. Na tento účel sa 1 g zásaditého fuchsínu rozomelie v mažiari s 5 g kryštalickej kyseliny karbolovej. Pre lepšie trenie sa odporúča pridať niekoľko kvapiek glycerínu. Potom postupne pridajte 10 ml 96% alkoholu. Do rovnomerne rozomletej hmoty sa postupne pridá 100 ml destilovanej vody, premieša sa a nechá sa 1-2 dni. Potom prefiltrujte cez papierový filter. Fuchsin Tsilya je perzistentný a môže sa uchovávať veľmi dlho. Používa sa na natieranie spór a baktérií odolných voči kyselinám, ktoré ťažko prijímajú farbu.
Pfeiffer purpurová(riedený fuchsín). 1 ml Ziehlovho karbolického fuchsínu sa zmieša s 9 ml destilovanej vody. Roztok je nestabilný, preto sa pripravuje bezprostredne pred farbením prípravkov. Používa sa na jednoduché farbenie náterov a dodatočné farbenie pomocou Gramovej metódy.
Karbolická genciánová violeť. 10 ml nasýteného liehového roztoku genciánovej violeti sa zmieša so 100 ml 5 % kyseliny karbolovej alebo 1 g genciánovej violeti sa v mažiari rozomelie s 5 g kryštalickej kyseliny karbolovej, 10 ml 96 % liehu a 100 ml destil. postupne sa pridáva voda.
Alkalická metylénová modrá(podľa Leflera). Do 100 ml destilovanej vody pridajte 30 ml nasýteného alkoholového roztoku farby a 1 ml 1 % roztoku hydroxidu draselného (KOH). Roztok sa prefiltruje. Farba je veľmi odolná a farbiaca sila starej farby je vyššia ako čerstvo pripravená farba.
Vodný roztok metylénovej modrej. 1 g metylénovej modrej sa rozpustí v 100 ml destilovanej vody.
Lugolov roztok. 2 g jodidu draselného sa rozpustia v 5 ml destilovanej vody a pridá sa 1 g kryštalického jódu. Objem sa upraví na 300 ml vodou. Lugolov roztok musí mať mierne zásaditú alebo neutrálnu reakciu. V prípade kyslej reakcie sa neutralizuje (podľa lakmusu) sódou bikarbónou. Roztok sa má uchovávať vo fľašiach z tmavého skla, chránený pred svetlom.
Príprava filtračného papiera impregnovaného genciánovou violeťou na Gramovo farbenie mikróbov v modifikácii Sinev. Roztok karbolickej genciánovej violeti sa umiestni na jeden deň do termostatu pri 37 °C a potom sa prefiltruje cez papierový filter. Filtrát sa naleje na platňu a na 1-2 minúty sa do nej ponorí filtračný papier narezaný na pásiky. Papier nasiaknutý farbou sa vysuší, nareže na kúsky (2x4 cm) a uloží do tmavých fliaš so zabrúsenou zátkou. Trvanlivosť je neobmedzená.
Poznámka.Čerstvo pripravené roztoky karbolických farieb majú na povrchu film s kovovým leskom. Tieto riešenia sú stabilné a vydržia pomerne dlho. Ak sa však skladujú príliš dlho, môžu sa stať nepoužiteľnými; v tomto prípade zmizne kovový lesk na ich povrchu a na dne sa vytvorí jemný práškový sediment.
Štátna rozpočtová vzdelávacia inštitúcia
Vyššie odborné vzdelanie
"Bashkir State Medical University"
Ministerstvo zdravotníctva a sociálneho rozvoja
Ruská federácia
Katedra farmakognózie s kurzom botaniky a základov bylinkárstva
"9" _ septembra _____2012
Disciplína BotanikaŠpecialita 060301 Lekáreň
Dobre 1 (oddelenie na plný úväzok) semester 1
Časť: „Náuka o bunke. Ergastické a sekrečné látky v rastlinnej bunke"
Laboratórna práca č.1
Na tému: „Optické mikroskopy. Vlastnosti botanickej mikrotechnológie. Osmotické vlastnosti rastlinnej bunky"
Laboratórna práca č.2
Na tému: „Štruktúra bunkovej steny. Plastidy, rezervné a minerálne inklúzie"
študentov
Ufa 2012
Laboratórna práca č.1
Téma hodiny: „Optické mikroskopy. Vlastnosti botanickej mikrotechnológie. Osmotické vlastnosti rastlinnej bunky"
1. Relevancia.Štúdium techník botanickej mikrotechnológie je nevyhnutnou podmienkou na zvládnutie praktických zručností v časti „Cytológia, histológia a anatómia rastlín“. Štúdium štruktúry rastlinnej bunky a jej osmotických vlastností dáva predstavu o bunkovej organizácii rastlinných organizmov, štrukturálnych vlastnostiach a rozdieloch od zvierat.
2. Ciele lekcie:
1. Získať zručnosti v práci s mikroskopom;
2. Nadobudnúť zručnosti pri príprave dočasných mikrosklíčok
3. Získať zručnosti v botanickej mikrotechnológii pre mikroskopickú analýzu celých, rezaných a práškových liečivých rastlinných materiálov;
4. Študujte štrukturálne znaky rastlinnej bunky
5. Študujte vlastnosti rastlinnej bunky
vedieť :
· prístroj mikroskopu a pravidlá práce s ním;
· história štúdia buniek, postuláty bunkovej teórie;
· štruktúra prokaryotickej bunky;
· štruktúra eukaryotickej bunky, jej hlavné organely;
· štruktúrne znaky rastlinnej bunky.
Na rozvoj odborných kompetencií musí študent byť schopný :
· pripraviť mikrosklíčko;
· skúmať mikroskopický preparát pod mikroskopom s malým a veľkým zväčšením;
· nájsť bunkové orgány;
· vykonať reakcie plazmolýzy a deplazmolýzy, uviesť teoretické zdôvodnenie;
Na rozvoj odbornej spôsobilosti musí študent vlastné :
· botanický pojmový aparát;
· technika mikroskopie a histochemická analýza mikropreparátov rastlinných objektov.
3. Požadované základné znalosti a zručnosti:
· moderné predstavy o stavbe prokaryotických a eukaryotických buniek, ich rozdieloch.
mikroskopické zariadenie.
4. Trvanie mimopracovnej práce– 2 akademické hodiny (90 min).
Otázky pre samoukov:
1. Mikroskop. Mechanické a optické systémy.
2. Pravidlá pre prácu s mikroskopom
3. Pracovná vzdialenosť. Rozhodnutie. Všeobecné zvýšenie.
4. Klietka. História štúdia. Bunková teória
5. Rozdiel medzi rastlinnou bunkou a bunkou huby a živočíchov
6. Štruktúra bunky. Jadro, štruktúra, funkcie.
7. Organely rastlinných buniek. Štruktúra, funkcie
8. Cytoplazma. Štruktúra, funkcie
9. Vakuola, štruktúra, funkcie
Vysvetlenie úloh
Mikroskop.
Mikroskop je opticko-mechanický systém, ktorý umožňuje získať vysoko zväčšené obrazy predmetov, ktorých rozmery sú ďaleko za rozlíšením voľného oka. Rozlíšenie oka je 0,15 mm. Rozlíšenie svetelných mikroskopov je 300-400-krát vyššie ako rozlíšenie voľného oka a rovná sa 0,1-0,3 mikrónu.
Mikroskop rozlišuje medzi optickými a mechanickými systémami. Optický systém pozostáva z osvetľovacieho prístroja, šošovky a okuláru. Mechanický systém pozostáva z revolvera, trubice, statívu, stolíka, makro a mikroskrutiek.
Osvetľovacie zariadenie obsahuje:
Kondenzátor (navrhnutý pre najlepšie osvetlenie, nastavenie ostrosti obrazu);
Irisová clona (určená na reguláciu priemeru svetelného lúča a hĺbky zorného poľa);
Zrkadlo (určené na nasmerovanie lúčov zo zdroja svetla do kondenzora).
Objektív je najdôležitejšou súčasťou optického systému. Šošovka vytvára obraz objektu s opačným usporiadaním častí. Zároveň odhaľuje („rozrieši“) štruktúry, ktoré sú voľným okom neprístupné.
Okulár slúži na pozorovanie obrazu vytvoreného šošovkou. Apertúra okuláru určuje hranice zorného poľa. Vo všeobecnosti šošovka a okulár poskytujú rozlíšenie mikroskopu a určujú celkové zväčšenie mikroskopu (celkové zväčšenie mikroskopu je definované ako súčin zväčšenia okuláru objektívu).
Mechanický systém mikroskopu je určený na montáž častí optického systému.
Práca s mikroskopom
1. Umiestnite mikroskop oproti ľavému ramenu, čím pred sebou vytvoríte miesto pre album. Umiestnite šošovku do pracovnej polohy. Správnu inštaláciu šošovky je potrebné posúdiť podľa cvaknutia, ktoré je cítiť pri otáčaní revolvera. Vzdialenosť medzi šošovkou a sklíčkom by mala byť asi 1 cm Práca s mikroskopom začína vždy s malým zväčšením.
2. Úplne otvorte clonu. Zdvihnite kondenzátor na úroveň stolíka. Nasmerujte svetlo pomocou konkávneho zrkadla tak, aby bolo celé pole jasne a rovnomerne osvetlené.
3. Pripravené mikrosklíčko položte na stolík tak, aby sa jedna z častí nachádzala presne pod šošovkou. Na upevnenie mikrosklíčka stlačte sklíčko pomocou svorky.
4. Pomocou makroskrutky nastavte požadovanú ohniskovú vzdialenosť, aby ste získali jasný obraz v mikroskope. Nastavte vzdialenosť pomocou mikroskrutky.
5. Pred prepnutím mikroskopu na vyššie zväčšenie zvoľte Správne miesto odrežte, umiestnite do stredu zorného poľa a až potom vymeňte šošovky opatrným otáčaním revolvera.
6. Po ukončení práce je potrebné prepnúť mikroskop na malé zväčšenie a vybrať mikrovzorku.
7. Po použití by mal byť mikroskop zakrytý uzáverom, aby bol chránený pred prachom.
Metodika prípravy dočasných mikrosklíčok
1. Predmet treba vziať do ľavej ruky a držať ho tromi prstami, v pravej ruke holiaci strojček alebo čepeľ.
2. Vyrovnajte povrch predmetu tak, aby rovina rezu bola kolmá na os orgánu. Rezy sa robia pohybom žiletky smerom k vám.
3. Pipetou naneste 2-3 kvapky vody do stredu podložného sklíčka a najtenšie časti preneste na hrot pitevnej ihly, predmet prikryte krycím sklíčkom. Tekutina by nemala vytekať spod krycieho sklíčka.
4. Pripravený prípravok položte na stolík a skúmajte ho pri malom a veľkom zväčšení.
5. Okrem dočasných príprav sa na štúdium predmetov používajú trvalé prípravky. Inklúzna kvapalina v nich je glycerín so želatínou alebo kanadským balzamom.
6. Pri farbení preparátu treba brať do úvahy, že vplyvom koncentrovaných kyselín môže dôjsť k zuhoľnateniu organických inklúzií v bunke, minerálne inklúzie (kryštály, drúzy, cystolity) môžu úplne zaniknúť alebo zmeniť svoj tvar.
7. Liek nemôžete vybrať spod šošovky x40, pretože... jeho pracovná vzdialenosť je 0,6 mm a predná šošovka sa môže ľahko poškodiť.
Bunka
Bunka je základnou stavebnou a funkčnou jednotkou všetkého živého. Bunky prvýkrát opísal Robert Hooke v polovici sedemnásteho storočia (1665), keď skúmal kus korku. Znalosti o bunke sa rozšírili s vylepšením mikroskopu. Do polovice devätnásteho storočia sa nazbieralo dostatok poznatkov o bunke - objav jadra, plastidov, bunkového delenia atď. Všetky poznatky o bunke zovšeobecnil na prelome 30.-40.rokov 19.stor. botanik M. Schleiden a zoológ T. Schwann vo forme bunkovej teórie.
Hlavné tézy (postuláty) bunkovej teórie:
1. bunka - stavebná a funkčná jednotka všetkého živého;
2. mnohobunkový organizmus je komplexne organizovaný, integrovaný systém pozostávajúci z fungujúcich a interagujúcich buniek;
3. všetky bunky majú homológnu štruktúru;
4. „bunka z bunky.“ Princíp bunkovej kontinuity delením založil v roku 1958 nemecký vedec R. Virchow.
Tvar, štruktúra a veľkosť buniek sú veľmi rôznorodé. Rastlinná bunka pozostáva z protoplast, membrána alebo bunková stena a vakuola.
Protoplast zahŕňa: cytoplazma, jadro, plastidy, mitochondrie.
Cytoplazma- časť protoplastu uzavretá medzi plazmalemou a jadrom. Základom cytoplazmy je jej matrica, príp hyaloplazma- zložitý, bezfarebný koloidný systém. Najdôležitejšou úlohou hyaloplazmy je zjednotiť všetky bunkové štruktúry do jedného systému, čím sa zabezpečí interakcia medzi nimi v procesoch bunkového metabolizmu. Cytoplazma vykonáva väčšinu procesov bunkového metabolizmu, s výnimkou syntézy nukleových kyselín.
Jadro- povinná a hlavná súčasť živej bunky všetkých eukaryotov. Funkcie jadra: ukladanie a reprodukcia dedičných informácií, riadenie metabolizmu a takmer všetkých procesov prebiehajúcich v bunke, syntéza nukleových kyselín, syntéza bielkovín. Jadro je obklopené plášťom pozostávajúcim z dvoch membrán nesúcich veľmi veľké póry. Vnútorný obsah jadra sa nazýva jadrová šťava alebo nukleoplazma. Jedno alebo viac jadier je ponorených do jadrovej šťavy.
Mitochondrie bunkové organely, ktorých tvar, veľkosť a počet sa neustále mení. Hlavnou funkciou je zabezpečenie energetických potrieb bunky prostredníctvom oxidácie energeticky bohatých látok (cukrov) a syntézou ATP a ADP. Mitochondrie sú obklopené dvoma membránami, vnútorná tvorí výrastky - cristae. Mitochondrie, podobne ako plastidy, sú poloautonómne organely, pretože obsahujú DNA a ribozómy v matrici.
Plastidy charakteristické len pre rastliny. Existujú tri typy plastidov: chloroplasty, chromoplasty a leukoplasty. Hlavnou funkciou chloroplastov je fotosyntéza, leukoplasty sú zásobárňou živín a chromoplasty sú farbou kvetov a plodov. Chloroplasty pozostávajú z dvojitej membrány, matrice, tylakoidov spojených v grane, DNA, ribozómoch a primárnych škrobových zrnách.
Golgiho komplex- sústava diskovitých vačkov a vezikúl obklopených membránami. Vykonáva funkcie syntézy, akumulácie a uvoľňovania určitých polysacharidov (pektíny, hlien atď.), Sekundárne metabolity; tvorba vakuol a lyzozómov; distribúcia a intracelulárny transport určitých proteínov; podieľa sa na stavbe cytoplazmatickej membrány.
ER (endoplazmatické retikulum) - systém submikroskopických kanálikov ohraničených membránami. EPS sa delí na hladké a hrubé. Funkcie hrubého ER: syntéza proteínov; riadený transport makromolekúl a iónov; tvorba membrány; interakcia organel. Funkciou hladkého ER je syntéza lipofilných zlúčenín.
Vákuola- dutina v bunke obklopená membránou (tonoplast) a vyplnená bunkovou šťavou. Bunková šťava je vodný roztok rôzne látky– produkty vitálnej aktivity protoplastov. Funkcie vakuol: akumulácia rezervných látok a odpadov; udržiavanie bunkového turgoru; regulácia rovnováhy voda-soľ v bunke.
Bunková stena oddeľuje bunku od jej prostredia. Jeho základom sú molekuly celulózy, ktoré sú zoskupené do mikrofibríl a fibríl. Molekuly celulózy sú ponorené do matrice, ktorú tvoria polysacharidy s viac rozvetvenou štruktúrou – hemicelulózy a pektíny, ako aj voda. Bunková stena je veľmi pevná a zároveň elastická. Molekuly celulózy mu dodávajú pevnosť a pružnosť - matricu. Bunková stena plní tvarotvorné a mechanické funkcie, poskytuje ochranu protoplastu, odoláva vysokému osmotickému tlaku vakuoly a cez bunkovú stenu dochádza k transportu látok.
Mikroskop.
V tomto článku vám prezradím 3 spôsoby prípravy prípravkov pre mikroskop. Tieto metódy sú najjednoduchšie.
Na začiatku článku je takzvaný slovník, alebo skôr vysvetlenie, čo je to ten či onen predmet.
Výroba mikrosklíčok si vyžaduje špeciálne nástroje, farbivá, ako aj istú dávku presnosti a zručnosti. Je veľmi dôležité prísne dodržiavať všetky nevyhnutné podmienky– v opačnom prípade môže byť mikrosklíčko nevhodné na výskum.
V predaji sú hotové sady liekov na výskum (čo je vhodné pre domácnosť a školu) - napríklad 25 liekov alebo 38 diapozitívov od Leeuwenguk. Rovnako ako minerály a iné sady.
Pozri KATALÓG mikroskopov.
vysvetlenia
Fixný liek- v mikrobiológii sa často pripravujú fixné preparáty, takže by ste mali vedieť, čo to je. Tieto prípravky sa skúmajú pod mikroskopom vo farebnej forme. Slovo „fixácia“ znamená také spracovanie živého objektu (o ktorom budete uvažovať), ktoré umožňuje rýchlo prerušiť životné procesy v konkrétnom objekte (vysvetlím to jednoduchšie - zabiť), pri zachovaní jemnej štruktúry. . V dôsledku fixácie sú bunky pevne pripevnené k sklu a sú lepšie zafarbené. Fixácia je nevyhnutná pri práci s patogénnymi mikroorganizmami (pre účely vlastnej bezpečnosti).
Pozastavenie- zmes akýchkoľvek látok, kde je tuhá látka rozložená vo forme malých častíc v kvapalnej látke v neusadzovanom stave.
Biologická slučka- tenká kovová tyčinka s tenkým kovovým očkom na konci. Používa sa na zachytenie malého množstva konkrétnej suspenzie mikroorganizmov.
Petrolatum- kvapalina podobná masti, bez zápachu a chuti. Zmes sa skladá z minerálneho oleja a parafínového vosku (voskovej zmesi).
Utesnenie- zabezpečenie dokonalej nepriepustnosti povrchov a spojov dielov pre rôzne plyny a kvapaliny.
Agar-agar- v mikrobiológii sa používa na výrobu pevných a polotekutých živných pôd, teda agarových pôd.
Carnoyova tekutina- kvapalina na fixáciu.
Horák- zariadenie s injektorom, ktorý je inštalovaný v kovovej rúrke s otvormi na vstup atmosférického vzduchu do tejto rúrky, ktorá je namontovaná na stojane s bočným vstupom na prívod plynu do rúrky, s otvormi vytvorenými na bočnom povrchu rúrky na ktorom sa zmení prívod vzduchu na horák, môže byť inštalovaná pohyblivá klapka, ktorá mení prietokovú plochu týchto otvorov.
Nikiforovova zmes- zmes rovnakých objemov etylalkoholu a bezvodého éteru síry, používaná na fixáciu krvných náterov, náterov orgánov a akýchkoľvek tkanív.
Príprava prípravku „rozdrvená kvapka“.
Príprava prípravku závesnej kvapky
Závesná kvapka.
- Pomocou biologickej slučky opatrne naneste jednu kvapku suspenzie mikroorganizmov (vopred pripravenú) na čisté krycie sklíčko.
- Prevráťte krycie sklíčko obsahujúce kvapku suspenzie tak, aby kvapka voľne visela.
- Umiestnite obrátené krycie sklíčko obsahujúce kvapku na jamku špeciálneho krycieho sklíčka s priehlbinou v strede.
- Kvapka by sa nemala dotýkať okrajov skla a priehlbiny (studne), mala by voľne visieť na krycom skle.
- Okraje vybrania špeciálneho krycieho skla sú vopred namazané vazelínou na utesnenie komory.
- Užite si pozorovanie baktérií na mikrosklíčkach!
Príprava prípravy „odtlačku“.
- Droga je pripravená!
- Pozor! Preparáty živých buniek sa skúmajú pomocou „suchých systémov“ mikroskopu. Po mikroskopii sa takéto prípravky musia pred umývaním uchovávať v dezinfekčnom roztoku (dezinfekčnom prostriedku).
Z agarového média, na ktorom rastú prípadné mikroorganizmy v absolútnom súvislom trávniku alebo vo forme jednotlivých kolónií, opatrne vyrežte skalpelom nie príliš veľkú kocku.
Preneste ju na podložné sklíčko tak, aby povrch kocky s mikroorganizmami smeroval nahor.
Potom na trávnik od mikroorganizmov alebo na včelstvo opatrne a nie nasilu, ale zľahka priložte bežné krycie sklo (absolútne čisté), pritlačte ho biologickou slučkou alebo pinzetou a ihneď odstráňte, dávajte pozor, aby ste ho neposunuli nabok. .
Výsledný prípravok (krycie sklo s potlačou) sa umiestni odtlačkom dole do kvapky obyčajná voda na čisté sklíčko. Odtlačok možno získať aj na podložnom sklíčku dotykom povrchu kolónie podložným sklíčkom.
Príprava prípravku „odtlačok“, iná metóda
Príprava prípravku "pevný náter".
- Pripravený!
Na prípravu tohto prípravku je potrebné naniesť jednu kvapku vody na podložné sklíčko bez tuku.
Vložte do nej materiál, ktorý testujete, pomocou biologickej slučky a rozdeľte ho tak, aby ste získali tenký a rovnomerný náter s priemerom približne 1-1,5 centimetra (iba pri takomto rozložení materiálu je možné vidieť izolované bakteriálne bunky v rozmazať).
Ak je testovaný materiál obsiahnutý v tekutom médiu, potom sa priamo nanesie na podložné sklíčko pomocou slučky a pripraví sa náter. Nátery sa sušia na vzduchu alebo v prúde teplého vzduchu nad plameňom horáka.
Na zafixovanie rozmazania sa veľmi opatrne 3-krát (iba na 3 sekundy) pretiahne podložné sklíčko (rozmazaním hore) cez plameň horáka. Mikroorganizmy v nátere pri fixácii odumrú, pevne sa prichytia k povrchu podložného skla a pri ďalšom spracovaní liečiva sa nevymývajú.
Pozor! Dlhšie zahrievanie môže spôsobiť deformáciu bunkových štruktúr. Krvné nátery, nátery orgánov a akýchkoľvek tkanív a (v niektorých prípadoch nátery z kultúr) sa fixujú ponorením na 5-20 minút do metylovej modrej alebo etylalkoholu, Nikiforovovej zmesi, tiež sublimovaného alkoholu alebo iných fixačných tekutín.
Príklady mikrosklíčok pre mikroskop
Zoznam mikrodiapozitívov v súprave 25 diapozitívov od WSBD World:
Voľné spojivové tkanivo
Miecha c.s. Prierez miechou
Motorické nervové zakončenie Zakončenie nervových buniek (neuróny)
Žalúdočný cicavec Sec. Rez tkaniva žalúdka cicavca
Oblička c.s. Prierez obličkou
Artery & Vein c.s. Prierez žilou a tepnou
Krvná cieva pľúc
Krvná cieva obličiek
Tase Bud Chuťový pohárik
Náter z úst Výter z ústnej sliznice
Smear z ľudských spermií
Mitóza živočíšnych buniek
Hydra thru Testis c.s. Hydra semenníky
Hydra thru Ovary c.s. Hydra vaječník
Hydra s Budom Hydra s výhonkom
Papraď Prothalium wm Výrastok paprade
Zea Mays Seed l.s. Rezané semená kukurice
Spirogyra Spirogyra
Lung Mammal Pľúca cicavca
Colon Mammal Hrubé črevo cicavca
Trachea cicavec Priedušnica cicavca
Pankreas cicavec Pankreas cicavca
Uterus Mammal Maternica cicavca
Slezina cicavca Slezina cicavca
Tipy na koreň cibule
Obsah ďalšej sady (38 kusov) - Levenhuk N38 NG sada hotových mikrosklíčok:
Botanika a zoológia:
Cibuľová šupka
Ražné zrno
Koreňový uzáver
Lipová ratolesť
Prašník
Vaječník
kamélia
Epidermis listu pelargónie
Včelí končatina
Včelie krídlo
Cyclops
Volvox
Euglena
Ciliate papuče
Dážďovka (prierez)
Ústa komára
Ascaris
dafnie
Biológia a fyziológia:
Mutácia Drosophila (bezkrídla forma)
Mutácia Drosophila (čierne telo)
Drosophila "norma"
živočíšna bunka
rastlinná bunka
Mucor pleseň
Drvenie vajíčka
Mitóza v koreni cibule
Pruhované svaly
Spermie cicavcov
Nerv (prierez)
Uvoľnené spojivové tkanivo
Cicavčie vajíčko
Nervové bunky
Hyalínová chrupavka
Hladký sval
Kosť
Žabia krv
Ľudská krv
Jednovrstvový epitel
